ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

1. 発現組換え Httex1 23Q と 43 q 必要なバッファーおよび解決を準備します。アンピシリン (アンプ、100 mg/mL) 原液、フィルター (0.2 μ m)、分注、-20 ° C でストア x 1000 を準備します。ホストゲノム スープ (LB) メディアの準備 (25 g ポンドあたり 1 L H2O ミラー)、オートクレーブ。1 M イソプロピル β-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) 原液、フィルター (0.2 μ m)、因数およびストアを準備-20 ° C で 化学有能なエシェリヒア属大腸菌熱ショック法34の His6 相撲 N 末端タグに融合した人間の Httex1 を含む pTWIN1 ベクトルを持つ ER 2566 B を変換します。注:エシェリヒア属大腸菌BL21 DE3 ひずみも使用されています。ただし、この場合は切り捨ての量の増加が観察されました。 1 LB 培地 200 mL に接種、寒天培地の滅菌ピペット チップから単一コロニーを追加して 1 L の三角フラスコにアンプ x。30 ° C と細菌のインキュベーターで 20 時間 (夜間) 180 rpm で文化を孵化させなさい。 滅菌ピペットと文化の 1 mL サンプルを取る。600 の光学濃度を測定使い捨てプラスチック キュベットと光度計 (測定範囲 0.1 ~ 1、LB 培地で希釈に応じて尊重) サンプルの nm (外径600)。3 L 文化で 0.05 の開始の OD600になります清酒の量を計算 (外径 φ600の清酒 = 50 mL を意味する 3)。 4 つのカルチャを接種する (1 LB 培地の各 3 L 5 L フラスコでアンプ x)、滅菌ピペットによる前処理の金額を追加することによって。37 ° C および細菌のインキュベーターで 180 rpm で文化を孵化させなさい。 30 分毎滅菌ピペットと文化の 1 mL サンプルを取る。使い捨てプラスチック キュベットと光度計で試料の外径600を測定します。外径 φ600 (通常 1-2 時間) 後 0.1 に達している、細菌の定温器の温度を 14 ° C に設定して冷却しながら培養を継続します。30 分毎滅菌ピペットと文化の 1 mL サンプルを取る。使い捨てプラスチック キュベットと光度計で試料の外径600を測定します。注: 文化を冷却する時間によって異なります使用、インキュベーターため冷却を開始する時刻がインキュベータの種類によって適応する必要がありますに。ただし、温度勾配の変更のみが必要収量に影響は小さい相撲融合タンパク質は、かなり安定するいると思われるようです。 外径600は (通常 1-2 時間) 後 0.3 0.4 に達したとき、過剰の SDS-PAGE 解析のため文化の前誘導サンプルを取る。セルの対等な量を与えるサンプル サイズを計算し、Coomassie の良い信号染色 SDS-PAGE: のために 10 もゲル: ボリューム = 0.2600を OD15 よくゲルの半分を取る。 外径600細菌文化 = 0.4、取る 500 μ L。滅菌ピペットで細菌培養の計算された容積を取る。スピン ・ ダウン (18000 g、4 ° C、2 分 x) サンプルと上澄みを廃棄します。解析 (ステップ 1.11) に使用する準備ができるまで、-20 ° C でペレットを維持します。 各 3 L の培養液に 1 M IPTG ストック溶液の分注 1.2 mL でタンパク質の発現を誘導する (最終濃度 0.4 mM)。14 ° c 16 h (一晩) 文化の培養を続けます。注: 温度が通常 ~ 20 ° C まで達しました IPTG を追加すると、インキュベーターの性能に応じて時間。 1.7 のステップで説明されている手順に従い、過剰発現の SDS-PAGE 解析のため文化の後誘導サンプルを取る。 1 L 管 (g, 4 ° C, 10 分 x 3993) 遠心分離によって細胞を収穫します。上澄みを廃棄し、氷の上細胞ペレットを浄化に直接進みます。 SDS ページ35,36によって発現を分析します。20 μ L バッファーとローディングの染料 × 2 の 20 μ L を実行するのには、前と後の誘導サンプルを再懸濁します。熱ブロック 95 ° C で 5 分間のサンプルを加熱し、まだ熱い間 15% ゲルの 20 μ L をロードします。V. 染色ゲル Coomassie 染料メーカーの指示によると 180 で 90 分のためのゲルを実行します。図 1Cの代表的な結果を比較します。注: プロトコルここで停止することができます、細胞ペレットを冷凍、数週間、-80 ° C で保存することができます。最適な結果を得るのためには、新鮮な細菌ペレットを使用し凍結を避けることをお勧めします。凍結融解は、細胞の換散および Httex1 の劣化をもたらすかもしれない。これは、収量およびタンパク質の品質を減らす可能性があります。 2. セル換散そして彼の6の浄化-相撲 Httex1 融合タンパク質固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) 2 L のガラス瓶の中のバッファーを準備 (50 mM トリス (ヒドロキシメチル)-aminomethan (Tris)、500 mM の NaCl、15 mM のイミダゾール)。(50 mM 500 mM の NaCl、トリス 500 mM のイミダゾール pH 7.4) のバッファー B のガラス瓶の中に、1 L を準備します。塩を溶解した後に、10 N 塩酸で pH 調整し、新鮮なボトルにソリューションをフィルター ボトル上部フィルター (0.65 μ m) と。1000 x phenylmethylsulfonyl フッ化物 (PMSF、0.3 M) を準備在庫ソリューション、-20 ° C で格納して 100 μ L 分注注: プロトコルは、逆相高速液体クロマトグラフィー (クロマトグラフィー) 浄化し 8-9 h の内で凍結乾燥細菌のペレットの溶解からすべての手順を完了できるように設計されています。集計とタンパク質を制限、一時停止せず急速に動作し、4 ° c または氷の上のすべての手順を実行しますそれをお勧めします。 中古冷蔵バッファー A. 追加バッファーに細菌のペレットの 100 mL に PMSF 原液とプロテアーゼ阻害剤の 5 錠 (最終巻の 30 mL あたり 1) の 100 μ L を追加し、電磁攪拌棒で攪拌し、wi 上下ピペッティングによる懸濁液を均質化第 10 mL の滅菌ピペット (30 分程度)。 細菌懸濁液を 50 mL の使い捨てプラスチック チューブ 40 mL の因数に分割します。セル換散 (70% 振幅、合計超音波処理時間 5 分、超音波照射 30 s、30 s の一時停止の間隔) の水/氷バッチでそれぞれ因数を超音波照射します。注: サンプルが超音波処理ステップの間に加熱していないことが重要です。超音波処理時の熱放散を改善するために氷風呂にいくつかの水を追加することをお勧めします。超音波処理の手順は、さまざまな楽器を使用する場合に適応する必要があります。フランス語プレスや、microfluidizer のような他の換散方法は同様に動作する必要があります、サンプル ・蛋白質集合体の加熱を避けるために有益である可能性があります。これらのデバイスは、私たちの研究室で利用できませんでした、私たちの超音波処理プロトコルで良い結果を得た。 ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 分析用溶解液 50 μ L のサンプルを取る。遠心分離機のサンプル (18000 g、4 ° C、2 分 x) と新しい試験管に可溶性のピペットします。ピペットとバッファー A の 50 μ L で不溶性画分を再懸濁します。SDS-PAGE 解析 (ステップ 2.6) まで氷のサンプルを保ちます。 遠心分離 (g, 4 ° C, 60 分 x 39191) によってライセートを明確に。 遠心分離のステップ中に SDS ページのセル換散一歩を分析します。ライセートの水溶性と不溶性分画に染料をそれぞれロード × 2 の 50 μ L を追加します。95 ° C で 5 分間加熱し、まだ熱い間 15% ゲルの 2 μ L をロードします。V. 染色ゲル Coomassie 染料メーカーの指示によると 180 で 90 分のためのゲルを実行します。図 1Cの代表的な結果を比較します。 上清 (0.45 μ m、シリンジ フィルター) をフィルター処理します。SDS-PAGE 解析 (ステップ 2.11) のフィルター処理された上澄みの 20 μ L のサンプルを取る。注: 通常、明確にし、フィルター処理された上澄みの 90 から 100 ミリリットルのボリュームが取得されます。通常、3 つのシリンジ フィルターで十分です。ろ過が面倒な場合、遠心分離速度や時間を増やしてみてください。 固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) の 4 ° C37高速性能液体クロマトグラフィー (FPLC) システム上で明らかに細菌の lysate から His6 相撲 Httex1 融合タンパク質を分離します。 明らかにし埋める superloop および Ni NTA 列にロードにライセート (実行前の空白を推奨する除去、洗浄、製造元のマニュアルに従って再読み込み、) 10 mL/分洗浄するバッファー A の 2 mL/分を渡す 10 列ボリューム (CV、200 mL) でうち非連結蛋白質。 2.5 との融合タンパク質を溶出バッファー B 2 mL/分での 100% の CV (50 mL) 使用分数サイズの読み込みと洗浄 50 mL と 5 mL の溶出。結果を図 1Dの代表的な結果を比較します。 SDS-PAGE 解析 (20 μ L) の各分画のサンプルを取るし、IMAC のクロマト グラムのピークによると融合タンパク質を含有する画分をプールします。追加 (2 s, 3 s) – 1, 4 – ビス (sulfanyl) ブタン-2, 3-ジオール (DTT) と L-システイン (最終濃度 100 mM) を粉末と軽くチューブを反転して解散。注: 我々 の経験の異なる画分の融合蛋白質の純度は同等です。念のため、精製された融合タンパク質の画分を高濃度の分数の凝集を予防する IMAC 後すぐにプールする必要があります。さらに、相撲タグと HPLC 精製の胸の谷間に直接続行することをお勧めします。必要に応じて、プロトコルがここで停止できます。融合タンパク質の希釈液は液体窒素で凍結、-80 ° C で保存、収量を大幅に削減することがなく解凍後精製しました。24 h 4 ° C で融合タンパク質の希釈液の保管も同様の結果を与えます。 SDS ページで IMAC を分析します。各サンプルにローディングの染料の 20 μ L を追加します。2 μ L の原料 (2.7)、非連結の割合、洗浄率と 15% ゲルの溶出ピークの各分画をロードします。V. 染色ゲル Coomassie 染料メーカーの指示によると 180 で 90 分のためのゲルを実行します。結果を図 1Dの代表的な結果を比較します。 3. 彼の胸の谷間6-相撲-タグと高速液体クロマトグラフィー精製 注意: トリフルオロ酢酸 (TFA) は揮発性の液体とことができます原因重症熱傷ので取り扱い注意。ヒューム フードのすべての処理を行い、適切な個人用保護具 (すなわち、使い捨てニトリル手袋、安全眼鏡、白衣) を着用します。 5 L ボトルで 5 L の水 (溶剤 a: H2O、0.1% (TFA) に TFA 5 mL プラスチック注射器を追加します。アセトニ トリルの 2.5 L ボトルに TFA 2.5 mL プラスチック注射器を追加 (溶剤 b: アセトニ トリル、0.1 %tfa)。 製造元が推奨する、高速液体クロマトグラフィー システムを準備します。きれいな列を確保するため空白を実行します。 ULP1 高精度 (ステップ 3.5) によって開裂反応を監視するための加算の前に融合蛋白質の 100 μ L のサンプルを取る。 新しい 50 mL のチューブに融合蛋白質の 20 mL を転送 ULP1 ストック溶液 0.4 mL を追加、氷の上を孵化させなさい。氷の上の残りの融合蛋白質を保ちます。注: 彼の付けられた触媒フラグメント 403 621 ユビキチン様特定プロテアーゼ 1 (ここで、”ULP1″と呼ばれる) は、相撲のタグを切断に使用されました。融合タンパク質は、劈開の Httex1 よりも安定です。バッチ全体が相撲タグを切断しないことをお勧めします。代わりに、HPLC カラムに直接、完全を適用できるサイズの因数を続行します。 10 分ごとには、超高性能液体クロマトグラフィー (高精度) で進行状況を監視する開裂反応の 100 μ L のサンプルを取る。遠心分離機のサンプル (18000 rpm、4 ° C、2 分) と分析による高精度 2 μ L (10% から 90% 溶剤 B 0.25 を 3 分間で、グラデーション、1 分間 10 %b 参照計測器の使用については、製造元の指示に従って)。サンプル ULP1 添加前に、と後に撮影サンプル得られたクロマト グラムを比較します。典型的な結果を図 2Bでの結果を比較します。 相撲胸の谷間が完了 (融合タンパク質のピーク高精度クロマト グラムの消えたし、は完全に新しく出現相撲と Httex1 ピークに変換されます)、サンプルのフィルター シリンジ フィルター (0.22 μ m)。注: 相撲胸の谷間は通常非常に高速 (4 ° C で 10-20 分) したがって 4 分の実行時間の高精度解析は反応を監視するための貴重なツールです。高速液体クロマトグラフィーの前にサンプルをフィルタ リング浄化は、カラムの寿命を延ばすに主に予防策です。このサンプルは、濁水にしないでください。 クロマトグラフィーによってフィルターが適用されたサンプルを浄化 (25-35% 溶剤 B 溶媒は、15 mL/分で 40 分以上の勾配 (0-10 分: 5%; 25 10 12.5 分: 5%; 12.5 52.5 分: 25 35%; 52.5 57.5 分 35 ~ 95%; 計測器の使用については、製造元の指示を参照してください)。結果を図 2Cの代表的な結果を比較します。注: Httex1 と彼の6-クロマトグラフィーによってよく別相撲。ただし、ピークの前後で切り捨てられた Httex1 の少量があります。純粋な材料の最大量を取得する小さな分数を収集します。注意: 使用時 (すなわち白衣、絶縁手袋、顔面シールド) 適切な安全装置低温流体を扱います。 エレクトロ スプレー イオン化質量分析法による HPLC 分画を分析 (MS、オートサンプラー、10 μ L を注入、0.6 mL/分、溶媒の流れ: 計測器の使用については、製造元の指示を参照してくださいでは、列がない場合、20 %b) と高精度 (10% から 90% へのグラデーション0.25 〜 3 分、1 分間 10% B a B 溶媒は計測器の使用については、製造元の指示を参照。)50 mL プラスチック チューブのような純度の分数をプール、液体窒素で凍結、凍結乾燥します。重量を量ると 2 mL プラスチック チューブに凍結乾燥タンパク質を転送し、-20 ° C で保存 高精度、ESI MS、SDS-PAGE による精製材料を特徴付けます。1.5 mL チューブに端正 TFA の 8 μ L で凍結乾燥させた Httex1 の 100 μ g を溶解し、クローズド テスト チューブに室温で 20 分間インキュベートします。慎重に窒素またはアルゴンの流れとヒューム フードの下で TFA を蒸発させます。窒素・ アルゴンの低圧を使用すると、サンプルの損失を回避します。 高精度で H2o. 分析 2 μ L の 100 μ L と 3.8 の手順と ESI 質量 5 μ L のタンパク質を溶解します。ミックス 20 μ L タンパク質溶液のローディングの染料 × 2 の 20 μ L。 SDS-PAGE により 10 μ g に 1 μ g の量を分析します。V. 染色ゲル Coomassie 染料メーカーの指示によると 180 で 90 分のためのゲルを実行します。結果を図 2Dの代表的な結果を比較します。 4. 解凝集および Httex1 タンパク質の Resolubilization 注意: TFA は揮発性の液体とことができます原因重症熱傷ので取り扱い注意。ヒューム フードのすべての処理を行い、適切な個人用保護具 (すなわち使い捨てニトリル手袋、安全眼鏡、白衣) を着用します。 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (137 mM NaCl、KCl 2.7 mM、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.4) 50 mL のチューブで予混合粉末からの 10 mL を準備します。各使用する前に 0.2 μ m のフィルターを通して DPBS ソリューションをフィルターします。 1.5 mL チューブに端正 TFA の 12 μ L で凍結乾燥させた Httex1 の 150 μ g を溶解し、クローズド テスト チューブに室温で 20 分間インキュベートします。慎重に窒素またはアルゴンの流れとヒューム フードの下で TFA を蒸発させます。サンプル38の損失を避けるために窒素・ アルゴンの低圧を使用します。注: 一般に、溶解し、蛋白質の 50 μ g の分解および 4 μ L TFA を使用します。このプロシージャは内部の膜タンパク質を作成テスト チューブの壁。次の手順で Httex1 の即時集計を防ぐためには、予冷バッファーを使用、氷の上に常に蛋白質を保つため、高濃度を避けるため。 予冷 DPBS 1 mL で分解されたタンパク質を溶解し、1 M NaOH で 7.2 7.4 に pH を調整します。1.5 mL プラスチック チューブ (20000 x g、4 ° C、20 分) に 100 kDa 遠心フィルターを通して蛋白質の解決をフィルターします。注: 計算される理論 Httex1 濃度は損失の可能性を考慮して必要な最終濃度より高いです。濾過手順中にタンパク質の分解を形成している可能性があります任意の集計を削除する必要です。 アミノ酸分析 (λ214検出) に基づく高精度校正曲線を用いた Httex1 の濃度を決定して 2 μ g のタンパク質をアミノ酸分析濃度10を検証するために送信します。3 μ M の濃度を得るために追加する必要があります DPBS の量を計算 Httex1。 テスト チューブに DPBS の金額を追加することによって 3 μ M にタンパク質を希釈します。集合のプロトコルの開始まで氷の上の管を保ちます。注: Httex1 43 q をソリューションに格納しないでください。常に上記のプロトコルに基づく新鮮なタンパク質溶液を準備します。Httex1 蛋白質、-20 ° C の凍結乾燥粉末として格納されます最高 5. 監視、集計速度の Httex1 43 q 高精度と円二色性 (CD) の分光と透過電子顕微鏡 (TEM) による骨材の特性を使用しての 以前に報告された39として TEM のウラニル ギ酸ソリューションを準備します。 Httex1 の集計を開始 37 ° c (分解プロトコルで上記溶液の 1 mL を使用) DPBS で 3 μ M ソリューションの孵化によって 43 q。注: 実験の目的とニーズに応じてより高い濃度で Httex1 の集計を実行できます。 (0、1、2、4、6、8、12、24、48 および 120 h) で示された時点で高精度を使用して水溶性の蛋白質の量を定量化します。これを行うには、35 μ L の因数を取る、遠心分離 (20000 g、4 ° C、20 分 x) によって不溶性の集計を削除します。上澄みの 4 μ L を高精度に注入します。計測器ソフトウェア40を使用してピーク面積の変更に基づく水溶性モノマーの比率を計算します。結果を図 3Aの代表的な結果を比較します。 0、48 h で CD 分光法を用いた二次構造の変化を特徴付けます。100 μ L を取るし、楕円率の測定 (1 mm 石英キュベット、195 nm ~ 250 nm、20 ° C、データ ポイントすべての 0.2 の nm、速度 10 nm/分、デジタル統合時間 2 s、帯域幅 1.0 nm)。サンプルと平均 6 スペクトルを取得し、99 のたたみ込み幅二項フィルターを用いた滑らかな。平均残基のモル楕円率 (θMRE)41としてスペクトルをプロットします。図 3Bの代表的な結果と結果を比較します。 TEM による骨材の構造と形態学的特性を特徴付けます。グリッド上にホルムバール/炭素コーティング 200 メッシュ、グロー放電銅 1 分洗って一度を 0.7% (w/v) ウラニル蟻酸塩及び 30 の汚れ 15 μ、15 μ L 水で二回グリッドのタンパク質溶液 3 μ L を入れて 0.7 %w/v ウラニル ギ酸の 15 μ L と s。グリッドの TEM 分析を実行します。図 3Cに代表的な結果と結果を比較します。