جيل مونومر Exon1 هونتينجتين الأصلية، وليس تمييز وييفات استخدام استراتيجية انصهار السومو
Summary
نقدم هنا، بروتوكول قوية ومحسنة لإنتاج كميات مليغرام من مونومرات أصلية وخالية من العلامة وييفات من exon1 البروتين هونتينجتين (Httex1) استناداً إلى الانصهار عابرة من معدل ubiquitin الصغيرة ذات الصلة (سومو).
Abstract
مرض هنتنغتون (HD) مرض موروثة الأعصاب قاتلة الناجمة عن عملية توسيع المساعدة النقدية (إيه ثري سيكس) في إكسون أول من الجينات عالية الدقة، أسفر عن التعبير عن البروتين هونتينجتين (Htt) أو الطرفي ن أجزاء منه مع (polyglutamine الموسعة الامتداد polyQ).
Exon1 البروتين هونتينجتين (Httex1) هو أصغر جزء Htt أن يلخص العديد من ميزات عالية الدقة في الخلوي والحيوان نماذج، وهو أحد أجزاء الدراسة على نطاق واسع من Htt. صغر حجم Httex1 يجعله تجريبيا أكثر قابلية لتوصيف الفيزيائية الحيوية باستخدام التقنيات القياسية وعالية الدقة بالمقارنة مع أجزاء أطول أو Htt كاملة الطول. ومع ذلك، تجميع عالية الميل للمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ زيادة المحتوى (إيه فور تو) جعلت من الصعب لتطوير كفاءة التعبير وأنظمة تنقية إنتاج هذه البروتينات بكميات كافية، وجعلها متاحة العلماء من مختلف التخصصات دون استخدام البروتينات الانصهار أو غيرها من الاستراتيجيات التي تغير التسلسل الأصلي للبروتين. نقدم هنا طريقة قوية ومحسنة لإنتاج كميات مليغرام من أصلي، العلامة خالية Httex1 استناداً إلى الانصهار عابرة من معدل ubiquitin الصغيرة ذات الصلة (سومو). بالبساطة والكفاءة الاستراتيجية سيقضي على الحاجة إلى استخدام تسلسلات غير أصلي من Httex1، وبالتالي جعل هذا البروتين أكثر متاحة للباحثين وتحسين إمكانية تكرار نتائج التجارب في مختبرات مختلفة. ونحن نعتقد أن هذه السلف سيسهل أيضا الدراسات المستقبلية الرامية إلى توضيح العلاقة بنية الدالة Htt، فضلا عن تطوير أدوات تشخيص الرواية والعلاجات لعلاج أو إبطاء التطور من [هد].
Introduction
Htt هو بروتين كاتشين 348، وقد تورط في عدة وظائف فسيولوجية1. عندما Htt يحتوي على منطقة polyQ موسعة من بقايا أكثر من 36 في نهايته N، فإنه يتسبب HD2،3. علم الأمراض HD يتميز بتضمينات الخلوية في المخطط واللحاء، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وضمور الأنسجة المتضررة4،5. تم اكتشاف الجثة العقول من المرضى عالية الدقة في عدة أجزاء Htt ن–المحطة الطرفية التي تحتوي على المسالك تكرار polyQ ويعتقد يمكن إنشاؤها بواسطة المعالجة بروتيوليتيك ل البروتين هونتينجتين6. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن Httex1 أيضا يمكن أن يتشكل بسبب الربط مرناً الشاذة. يحتوي Httex1 على الطفرة polyQ المرضية وما أوفيريكسبريشن في الحيوانات يمكن أن الخص العديد من السمات الرئيسية هد7، وبالتالي إبراز دور مركزي ممكنة لهذا الجزء في هد علم الأمراض والأمراض تطور6، 8،9.
سبب تجميع عالية الميل للمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ توسيع المسالك، تستند غالبية النظم القائمة على التعبير الانصهار عابرة من Httex1 للبروتينات (مثل الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST)، ثيوريدوكسين (TRX) أو مالتوس-ملزمة-البروتين (MBP) و/أو الببتيدات (بولي-الحامض الأميني) أن تحسين متفاوتاً في التعبير والذوبان في الاستقرار وتنقية10،11،،من1213،14 ،،من1516،17،،من1819،20،21،22،23 ،،من2425،26،،من2728. شريك الانصهار ترتبط Httex1 مع سلسلة قصيرة تحتوي على موقع انقسام البروتياز مثل التربسين، ذكر أحفر حوزتي الفيروس (TEV) أو بريسسيسيون للسماح للانقسام وإطلاق سراح Httex1 قبل الشروع في تجميع أو تنقية. وتشمل أوجه القصور في هذه الطرق إمكانية ترك مخلفات إضافية نظراً للانقسام وغير تراسيليس وإنشاء أجزاء مبتورة بسبب ميسكليفاجي ضمن تسلسل Httex1، بالإضافة إلى عدم التجانس نظراً للانقسام وغير مكتملة ( انظر فيفيغ et al. لمزيد من المناقشات المتعمقة عن مزايا وقيود هذا النهج)10. لمعالجة هذه القيود، وضعنا مؤخرا استراتيجية تعبير تمكين توليد Httex1 خالية من العلامة الأصلية للمرة الأولى باستخدام انصهار الطرفي ن عابرة من سينيتشوسيستيس sp. (Ssp) انتئين دناب إلى Httex110. بينما الانقسام انتئين traceless ومحددة وتعطي كمية ملغ من البروتينات، فإنه لا يزال يعاني اثنين من العوائق التي يمكن أن تقلل من العائد: إلا وهي سابقة لأوانها الانقسام من انتئين التي يمكن أن تحدث أثناء التعبير، وحقيقة أن يحدث انشقاق أكثر عدة ساعات، مما قد يؤدي إلى فقدان البروتين نظراً للتجميع، لا سيما بالنسبة Httex1 مع تكرار polyQ الموسع.
لمعالجة هذه القيود وصقل استراتيجيتنا لإنتاج أصلي، خالية من علامة Httex1، طورنا نظام تعبير جديد يستند إلى الانصهار عابرة من السومو، أكثر تماما الخميرة هومولوج Smt3 إلى Httex1. تطبيق نظام السومو لإنتاج البروتينات المؤتلف نشرت لأول مرة في عام 200429، حيث اتضح زيادة معدل التعبير والذوبان من البروتين الانصهار السومو. يمكن المشقوق العلامة السومو من أوبيكويتين مثل البروتين-خاصة بحوزتي 1 (ULP1)، التي لا تتطلب اعتراف بموقع، ولكن يعترف هيكل التعليم العالي السومو ويلغي عمليا إمكانية ميسكليفاجي30. وعلاوة على ذلك، الانقسام و ULP1 بوساطة سريع وتراسلس ولا تترك بقايا إضافية. الانقسام سابق لأوانه للعلامة الانصهار، كما لاحظت مع انتئين أوتوكاتاليتيك10، هو تجنبها تماما بشرط حوزتي الخارجية. في حين أن استراتيجية سومو يستخدم على نطاق واسع في الوقت الحاضر للبروتين المؤتلف إنتاج31،،من3233، نظهر في هذه الورقة أنها مفيدة بشكل خاص للجيل من المختلين جوهريا، بروتين أميلويدوجينيك المعرضة للتجميع، مثل Httex1. ونحن نعتقد أن البساطة والكفاءة ومتانة أسلوبنا سومو-المستندة إلى الانصهار سوف تجعل Httex1 الأصلية، وخالية من علامة أيسر منالاً للباحثين من مختلف التخصصات والقضاء على الحاجة إلى استخدام تسلسلات غير أصلي من Httex1 في المختبر . وهذا تقدم هام التي ستسهل الدراسات المستقبلية توضيح علاقة بنية الدالة Httex1.
يصف البروتوكول تنقية Httex1 من 12 ل ثقافة البكتيرية، ولكن البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لمقياس أصغر أو أكبر للإنتاج. وصف البروتوكول إنتاج نوع البرية Httex1 (wtHttex1) مع polyQ طول تكرار أدناه (23Q) والمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ تكرار طول أعلاه (43Q) على عتبة المسببة للمرض (36Q).
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، وقد اوجزنا إجراء فعال للحصول على كميات مليغرام من أصلي، تمييز Httex1 التي تحتوي على بقايا الجلوتامين 23 أو 43. وقد تحقق ذلك بالإعراب عن Httex1 كالتحام المحطة طرفية ج له6-العلامة السومو، التي تستخدم لعزل البروتين الانصهار من الخلية ليستي ايماك وهو المشقوق قبل تنقية [هبلك] من Httex1. بينما قد استخدمت استراتيجية السومو في إنتاج العديد من البروتينات الأخرى، لدينا أسلوب يظهر أن خصائص فريدة من نوعها السومو يمكن استخدامها أيضا لتوليد جوهريا اضطرابه، المعرضة للتجميع، بروتين أميلويدوجينيك التي أثبتت سابقا أن تكون الصعوبة بمكان التعامل معها وتنتج43،44. نقدم بروتوكول التي واضحة وسهلة الاستخدام وقابلة للمقارنة لوضع بروتوكول للجيل من البروتين “تصرفت بشكل جيد”. سولوبيليزيس الانصهار السومو وتستقر Httex1 أثناء التعبير والخطوة تنقية ايماك. الانقسام سابق لأوانه للعلامة، كما لاحظت مع استراتيجية انتئين10 والتجميع لم تعد مشكلة.
البروتينات اضطرابه جوهريا عرضه للتدهور. في حين تدهور الطرفي ن في منطقة N17 ليست قضية استخدام هذا البروتوكول، يمكن أن تحدث ترونكيشنز في دلتا نهر اللؤلؤ Httex1. كما أن البروتينات مبتوراً متشابهة جداً إلى Httex1 في هيدروفوبيسيتي، تهمة، وحجم، وإزالتها بالوسائل الكروماتوغرافي التحدي، وبالتالي فمن الأفضل لمنع تكونها في المقام الأول. تخرج عن كثب للبروتوكول، تعمل دائماً على الجليد واستخدام كمية كافية من مثبطات البروتياز ينبغي أن تساعد الحفاظ على مستوى من الملاحظ اقتطاع منخفضة للغاية. تطبيق علامة انصهار في ج-محطة Httex1 يمكن إزالة truncations في دلتا نهر اللؤلؤ بسهولة كما سيفقد البروتين مبتوراً علامة تقارب كذلك. ومع ذلك، إذا كان التسلسل الأصلي الذي يحتاج إلى الإبقاء على هذا الخيار لا يمكن تطبيقها كما Httex1 ينتهي مع برولين والأفضل من معرفتنا هناك لا علامات الانصهار ج-محطة معروفة للحث على الانقسام وتراسلس وكفاءة بعد برولين.
الجزء الأكثر أهمية من البروتوكول هو التعامل مع Httex1 حررتها بعد انشقاق العلامة سومو ULP1. يجب تنقية البروتين مباشرة بالبرنامج العادي-[هبلك]. لحسن الحظ، وهذا هو فعل تتسم بالكفاءة والسرعة التي عادة ما يتم الانتهاء في 10-20 دقيقة في 4 درجات مئوية. وفي المقابل، المطلوب الاستراتيجية انتئين عدة ساعات للانقسام كاملة من انتئين، مما يتطلب مفاضلة بين الانقسام غير مكتملة وبداية التجميع من أجل تعظيم العائد. Workup سريع مطلوب للمسخ Httex1، كما أنها ستبدأ بتجميع بتركيز عال نسبيا في رد فعل الانقسام، بينما البديل 23Q مستقرة لفترة أطول. أثناء تنقية RP-[هبلك]، ميزة أخرى من السومو يصبح واضحا: حين انتئين دناب Ssp هو مسعور، وتتمسك بقوة بالعمود، سومو هو أكثر ماء والتيس تماما من العمود عكس المرحلة C4. على الرغم من أن ULP1 تجارية مكلفة جداً، يمكن أن تنتج البروتين بسهولة في عالية الغلة بعد29من البروتوكولات نشرت سابقا.
لا يمكن أن تكون الأهمية القصوى لتطبيق بروتوكول تفصيل قبل استخدام Httex1 التشديد. البروتينات polyQ المجففة بالتبريد مثل Httex1 مستقرة ويمكن أن تكون مخزنة في فترات طويلة، ولكن ليست تماما للذوبان في المياه والمخازن المؤقتة. يمكن أن يكون وجود ليغومرات بريفورميد أو ييفات أثر كبير على حركية التجميع والخصائص الفيزيائية ل البروتين45. يسمح البروتوكول تفصيل الموصوفة هنا التفصيل للبروتين، وإزالة الركام بريفورميد وجيل من حل أحادي Httex1 من عينة المجففة بالتبريد. لاحظنا مورفولوجيا حركية وفيبريل تجميع مماثلة للحصول عليها مع السومو واستراتيجية انتئين Httex1.
مقارنة بالطرق السابقة لإنتاج Httex1، الاستراتيجية سومو الموصوفة هنا يوفر العديد من المزايا، ويوسع نطاق الدراسات المحتملة للتحقيق في هيكل وخصائص وظيفية لهذا البروتين في الصحة والمرض. البروتين الانصهار سومو-Httex1 سهلة للتعامل، يمكن تجميد وتخزين أو الاحتفاظ في حل أجل 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، في حين أن إجمالي mHttex1 الحرة بسرعة. الاستقرار والذوبان عالية من البروتينات الانصهار Httex1 سومو توفير قدر أكبر من المرونة التعامل مع البروتين و/أو إدخال تعديلات الانزيمية والكيميائيه في mHttex1 بخلاف ذلك لن يكون ممكناً بعد الانقسام. ويشمل ذلك إدخال التعديلات بوستترانسلاشونال، فلوروفوريس، وتدور التسميات، العلامات البيوتين، إلخ أن السلف المقدمة هنا 1) تسهيل الدراسات المستقبلية توضيح العلاقات بنية دالة من Httex1؛ 2) إنشاء أدوات جديدة للتحقيق Htt تجميع ونشر الأمراض؛ 3) تمكين تطوير فحوصات جديدة لتحديد الجزيئات التي تستقر المسخ Httex1 ومنع التجميع بها؛ و 4) تشجيع العلماء من الحقول الأخرى لكي تعمل على هذا البروتين والانضمام إلى سعينا لإيجاد علاج لمرض هنتنغتون.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل أساسا من المنح المقدمة من مؤسسة يعقدها و “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية”. ونشكر الدكتور صوفي فيفيغ لإجراء مناقشات مفيدة أثناء تطوير هذا النظام الجديد للتعبير وأعضاء آخرين من مجموعة لاشويل لتقاسم خبراتها مع هذا النظام التعبير وملاحظاتهم الإدخال وقيمة. ونشكر أيضا الأستاذ أوليفر هانتشيل لتوفير بلازميد ULP1. يشكر المؤلفون الدكتور جون وارنر باء والدكتور يونس ك. تانجاراج لاستعراض نقدي لهذه المخطوطة
Materials
| Uranyl formate (UO2(CHO2)2) | EMS | 22450 | |
| Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids | EMS | FCF200-Cu-50 | |
| High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics | HellmaAnalytics | 110-1-40 | |
| Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA | Witech | SVA4730203 | |
| Ampicillin | AxonLab | A0839.0100 | |
| Luria Broth (Miller's LB Broth) | Chemie Brunschwig | 1551.05 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | AxonLab | A1008.0025 | |
| E. coli B ER2566 | NEB | NEB# E4130 | |
| Imidazole | Sigma | 56750-500G | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 | Merck Millipore Corporation | MAB5492 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) | Licor | 925-68070 | |
| PMSF | AxonLab | A0999.0005 | |
| HisPrep 16/10 column | GE Healthcare | 28936551 | |
| C4 HPLC column | Phenomenex | 00G-4168.P0 | 10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19×10 mm guard column, not temperature jacketed |
| Acetonitrile HPLC | MachereyNagel | C2502 | |
| Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile | Sarstedt AG | 83.1826 | |
| Spectrophotometer semi-micro cuvette | Reactolab S.A. | 2534 | |
| Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml | GE Healthcare | 18111382 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml | Greiner Bio-One | 7.160 102 | |
| 100 kD Microcon fast flow filters | Merck Millipore Corporation | MRCF0R100 | |
| Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor | Sonics | ||
| Äkta 900 equipped with a fraction collector | GE Healthcare | ||
| Jasco J-815 Circular Dichroism | Jasco | ||
| Waters UPLC system | Waters | C8 BEH acquity 2.1×100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL | |
| waters HPLC system | Waters | 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing | |
| ESI-MS: Finnigan LTQ | Thermo Fisher Scientific | ||
| lyophylizer instrument | FreeZone 2.5 Plus | ||
| Tecnai Spirit BioTWIN | FEI | electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV | |
| 37 °C shaking incubator | Infors HT multitron Standard | ||
| Biophotometer plus | Eppendorf |
Referencias
- Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
- MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington’s disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
- Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19 (2006).
- DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
- Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
- Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
- Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
- El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
- Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
- Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
- Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
- Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
- Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington’s disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
- Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
- Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington’s disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
- Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
- Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
- Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
- Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
- Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
- Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
- Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
- Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
- Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
- Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
- Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
- Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
- Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Bioquímica. 54 (25), 3942-3949 (2015).
- Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
- Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
- Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
- Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
- Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
- Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
- Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
- Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- O’Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
- Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
- Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
- Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
- Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
- Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
