黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

承認機関のプロトコルを使用してすべての人間の組織の仕事を行った。 1. 人間の皮 (割礼から少年包皮) から真皮と表皮の分離 非接着剤無菌細胞培養皿 (Ø 10 cm) に包皮 (通常 1-2 cm2) を置き、リン酸緩衝生理食塩水+の 10-12 ml カバー (pH 7.2 0.9 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2PBS PBS+=)。生殖不能のメスと鉗子を使用してすべての余分な (脂肪) の組織を削除します。 3 × 5 mm の部分に皮膚を切り取って、PBS で洗浄し非接着剤無菌細胞培養皿 (Ø 6 cm) に転送。当期ソリューション (PBS で 2 U/mL) の 5-7 ml 組織部分をカバーします。パラフィンの膜と細胞培養ディッシュを封印し、4 ° C で 16 時間インキュベート 2 滅菌ピンセットで表皮真皮の一部からを撤回します。個々 の非接着細胞培養皿 (Ø 6 cm) に切り裂かれたティッシュ部分を転送し、PBS+でそれらのそれぞれをカバーします。 2. 表皮からプライマリ ケラチノ サイトの分離 慎重にパスツール ピペットを使用して細胞培養ディッシュから PBS+を削除し、PBS の表皮部分 (セクション 1.3 より) を洗浄します。小さな断片 (1 mm2) に表皮を切断し、50 mL の円錐管にそれらを収集します。10 mL 1 を加えてトリプシン-EDTA (37 ° C に予熱) x 37 ° C の水浴中で 5 分間インキュベートし、渦組織懸濁液 2 分ごと。 1 mL 牛胎児血清 (FCS) を追加することによって酵素反応を停止します。上下に 4 分泡を避けるためし、泡の形成を試みる 10 mL プラスチック ピペットでピペッティングにより細胞を再懸濁します。 ピペットにセル ストレーナー (細孔サイズ 100 μ m)、細胞懸濁液は新鮮な 50 mL の円錐管の上に配置、5 mL の PBS で 3 x をすすいでください。200 x g で細胞を遠心分離機の 5 分 1% (v/v) ゲンタマイシンを含む 2-6 mL 培養液中の細胞ペレットを再懸濁します。コート t75 フラスコ細胞培養用フラスコに検定と種子 6 × 105セルのカウントの細胞によって手動でセル数を決定します。 3. プライマリ ケラチノ サイトの栽培 手順 2.3 表皮細胞中の 37 ° C および 5% の CO2のセルのインキュベーターで FCS、なし 50-70% の confluency に分離されたプライマリ ケラチノ サイトを孵化させなさい。 ケラチノ サイトを慎重に通過するメディアを取り出して、5 mL PBS-EDTA を追加し、37 ° C で 10 分間細胞をインキュベート細胞を光学顕微鏡による培養用フラスコからデタッチし始めているかどうかをチェック (4 X 倍率: 細胞は丸い表示されますが、まだ接続されている!)。場合は、新鮮な PBS-EDTA と古い PBS-EDTA を交換し、再 37 ° C で別の 10 分間インキュベート 5 ml 1 x 丸い細胞をトリプシン-EDTA まだ 10 mL PBS EDTA で覆われ、37 ° C で 1-3 分間インキュベートして再1 mL FCS を追加することによって酵素反応を停止し、50 mL の円錐管の剥離細胞を収集します。5 分間 200 x g で細胞を遠心分離機、新鮮なコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコにケラチノ サイトの中規模、およびシード 6 × 105細胞ペレットを再懸濁します。注: 脊髄皮膚の再構築を生成するには、プライマリ ケラチノ サイト使用してください遅くとも 3-4 の通路。 4 主な真皮線維芽細胞の分離 小さな断片 (1 mm2) に皮膚の組織 (セクション 1.3 より) をカットし、50 mL の円錐管にそれらを転送します。10 mL のコラゲナーゼ溶液 (PBS+で 5 U/mL) を追加し、37 ° C の水浴中で 45 分間インキュベート組織の部分と 5 分の 200 x g で細胞の混合物を遠心分離機します。 2 回 10 mL DMEM 含む 4.5 G/L グルコースと L-グルタミンが L ピルビン酸、細胞ペレットを洗浄します。最後に 2 ml の 1% (v/v) ゲンタマイシンと 10% の FCS を含む DMEM の組織部分を再懸濁します。T25 細胞培養用フラスコに移して、一晩それら 37 ° C、5% CO2でセルのインキュベーターで孵化させなさい。注: 小さなボリュームができ組織破片から移行する線維芽細胞培養用フラスコにアタッチすることを強制します。 次の朝は、別 6 mL DMEM、ゲンタマイシン、FCS を追加し、37 ° C で 2-3 日間インキュベート細胞が 80-90% の confluency に達するまでします。 5 主な線維芽細胞の培養 繊維芽細胞を通過するには、媒体を取り外し、付着性のセル PBS で洗浄します。5 mL 1 を加えてトリプシン-EDTA x 37 ° C で 3 分間インキュベートし、 5 mL DMEM/FCS を追加することによって酵素反応を停止し、50 mL の円錐管の剥離細胞を収集します。5 分間 200 x g で細胞を遠心分離機、DMEM 培地でペレットを再懸濁しますで新鮮なコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコに 6 x 10 の5セルをシードします。注: 脊髄皮膚の再構築を生成するには、主な線維芽細胞使用してください遅くとも 4-6 を通過します。 6. 悪性黒色腫 3 D 回転楕円体を介してハンギング ドロップ法の生成 培養メラノーマ細胞 (例えば451-LU、または関心の悪性黒色腫細胞線) RPMI 10% FCS15を含むを使用して一般的なプロトコルに従って。 同様のサイズと品質の黒色腫の回転楕円体を生成するには、PBS のメラノーマ細胞を洗浄、細胞培養用フラスコ、室温 (RT) で 3-5 分間インキュベート トリプシン-EDTA、T175 で細胞を PBS で 1 x 5 mL を加えます。5 mL RPMI/10% FCS を追加してトリプシンを中和します。収穫 200 x g で 5 分間の遠心分離によって細胞再診断でカウントすることによって決定される 10,000 のセル/mL の最終的な集中に RPMI/FCS で細胞ペレットを中断します。 電子マルチ ピペットを使用して滅菌非接着細胞培養ディッシュ (Ø 10 cm) の蓋の内側の表面にセル中断の 40 x 25 μ (= 250 セル) を見つけます。高速ではスムーズな動きで蓋を振り返るし、5 mL の PBS を含むそれぞれの細胞培養皿の上に置きます。 「ハンギング ドロップ料理」10-14 日間、使用細胞の種類に応じて細胞インキュベータ 37 ° C、5% CO2で文化。注: MM 成長期から細胞は、通常より速く成長し、RGP や VGP 由来悪性黒色腫細胞と比較してハンギング ドロップでより強固スフェロイドを形成します。個別の評価では、回転楕円体の成長倍率の双眼鏡の下または光学顕微鏡 (4 倍) の下を確認します。通常、回転楕円体は双眼鏡のペアまたは光学顕微鏡 (4 倍) で 48 時間後に検出になります。10-14 日後倍率デバイスを使用せずに表示されます。 最初のドロップダウンをスポッティングした後 5 日間は、各ドロップに培 RPMI/10% FCS の 10 μ L を追加します。その後、他の毎日媒体の 10 μ L を交換します。電子ディスペンサーの使用は、このステップで非常に便利です。 セルの種類に応じて優しく洗浄して PBS で細胞培養皿のふたによって 10-15 日後回転楕円体 (詳細についてはセクション 10 を参照してください) を収穫します。新鮮な非接着性細胞の培養皿にそれらを収集します。注: 栽培期間によって異なります腫瘍成長期メラノーマ細胞の彼らは当初得られたとき例えば、451 LU 細胞由来スフェロイド成長直径約 500 μ m にハンギング ドロップ15 で培養 12 日以内. 7. 切片における皮膚の真皮のコンパートメントの世代を再構築します。 24 ウェル セル多孔膜挿入 (サイズ 8 μ m の細孔) 24 ウェルに配置されますを使用して皮膚モデルを生成します。注: ぶら下げを使用しないことを確認してください、彼らは後の段階で空気液体培養 6 ウェル プレートに配置されますので、挿入を立っています。 ゲル中和ソリューション (GNL)15として血管内皮成長メディア (EGM)16,17MM と呼ばれ、文化メディアを準備します。凝固を防ぐためには、ストア コラーゲン I 型 (通常はラットの尾、3.5 4 mg/mL 0.02 N 酢酸) から氷の上まで使用、室温ゲル開始するため 再 GNL の挿入あたり 1 x 105の線維芽細胞を中断し、すぐに細胞懸濁液を 500 μ L/挿入の最終巻の 1:3 の割合でコラーゲンに混ぜてください。泡が皮膚の品質を損なうことがありますバブル形成を避けるために上下に軽くピペッティングでミックスを再構成します。 無菌フードで 30 分間常温媒体なしそれらを保つことによって解決する個々 の皮膚ゲルを許可します。その後 4.5 G/L グルコース、1% を含む DMEM にゲルをカバー L グルタミン、10 s と L-ピルビン酸、37 ° C で一晩インキュベートし、 8. 切片における皮膚の表皮のコンパートメントの世代を再構築します。 次の日皮膚ゲルからメディアを取り出して、EGM メディア (10 s、1 %penstrep, 10 mg/mL ゲンタマイシン) 37 ° C で 2 時間でそれらを平衡媒体を撤回し、慎重に種子 1 x 105ケラチノ サイト 100 μ L EGM 皮膚のゲルの上で再停止されます。 皮膚の区画に準拠するケラチノ サイトを許可する 37 ° C で 1.5 h の再構築を孵化させなさい。注: このインキュベーション時間の間に、ゲルは線維芽細胞収縮により縮小し、したがって、少なくとも部分的に挿入壁からデタッチ開始されます。 約 800 μ L EGM で同等の肌をカバーし、小 (白) ピペット先端挿入壁から残留ゲルを慎重に取り外します。肌と同等の EGM に 37 ° c、5% CO2セルのインキュベーターで 7 日間浸漬を文化し、一日おきに媒体を変更します。注: この時間の間に同等の肌が大幅に縮小します。 9. 空気液体培養切片における皮膚の再構築します。 8 日目、各転送 6 ウェル プレートの各ウェルに挿入します。のみ皮膚再構成付属は井戸の底から媒体が媒体に覆われていない各ウェルに MM 媒体の 1.2-1.4 mL を追加します。メモ: 気液界面培養表皮部分と完全角質層 (角質層) の確立の層別化をできます。 次の 10-17 日間 9.1 一日おきの項で述べたように媒体を変更します。この期間中に薬や媒体に必要な他の刺激を追加します。さらに分析、例えば、免疫組織化学的解析 (図 1) のピンセットを使用して微多孔性膜挿入から完全皮膚再構成を慎重に取り外します。 10 脊髄悪性黒色腫回転楕円体の皮膚モデルの生成 切片における皮膚の再構築の皮膚のコンパートメントに悪性黒色腫の回転楕円体を統合して慎重にすすいでください (手順 6.4) の後では絞首刑のふたを回転楕円体 PBS でドロップ細胞培養ディッシュ。生殖不能の非接着細胞培養皿で 10-20 回転楕円体/挿入を収集します。パスツール ピペットの過度の PBS を慎重に取り外します。 EGM の可能な最小ボリュームの回転楕円体を吸い出しなさい。この時点で観察し、さらに倍率デバイスがなくても、肉眼で回転楕円体を数えます。10.1 のステップのとおり皮膚モデル/ゲルあたり 10-20 回転楕円体を取る。 (ステップ中 7.3)、線維芽細胞を含む GNL の適切なボリュームに転送してコラーゲンの種類ミックス私。このステップから、セクション 7.3 9.1 で説明を進みます。注: 腫瘍回転楕円体は、白い斑点 (図 2) として皮膚ゲルに表示されます。