כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

שושנת יריחו מתייחס לקשת רחבה של מחלות האדם הנגרמת על ידי טפילים protozoan מינים של הסוג לישמניה. כ- 12 מיליון אנשים נגועים כרגע לישמניה ברחבי העולם, בלמעלה מ-350 מליון נמצאות בסיכון. המחלה פתולוגיה תלוי על מינים לישמניה מארח הגורמים, הסימפטומים משתנים בין נגעים בעור ריפוי עצמי לא מזיק לטפסים visceralizing קטלני. אם אינה מטופלת כראוי, מהבטן לישמניה קטלנית, הדירוג רק לאחר מלריה כמו המחלה האנושית הקטלני ביותר הנגרמת על ידי זיהום עם טפילים protozoan¹. למרות ההבדלים למחשוב המחלה פתולוגיה ותסמינים, כל המינים לישמניה יש digenic-מחזור חיים לסירוגין בין promastigote ו amastigote שלבים בתוך חרק מארחים חוליות, בהתאמה. בתוך החוליות, לישמניה המטרה המארח מקרופאגים לפלישה, לגרום להיווצרות וקואלות parasitophorous (PVs), תאי חומצי עם המאפיינים של phagolysosomes שבו לשכפל הטפסים amastigote מאוד מידבק. Amastigotes נמשכות ברקמות מארח במהלך זיהומים כרוניים, ניתן להעביר זבובי־חול מצפים נגוע, להשלמת המעגל שידור. לכן, בהקשר של התפתחות מחלות אנושיות, amastigotes הם החשובים ביותר לישמניה מחזור טופס². חוקר איך לשכפל את amastigotes בתוך מקרופאג PVs הוא קריטי עבור הבנה לישמניה התקפה אלימה^3,4,5,6,7 ועבור פיתוח טיפולים חדשניים אפקטיבי.

נתאר כאן שיטה המשמשת באופן קבוע על ידי מעבדה שלנו ללמוד דלקת לישמניה ושכפול של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs), אשר כוללת הערכה כמותית של מספר תאיים לישמניה לאורך זמן. התהליך כרוך קצירת ומונוציטים מ מח עצם העכבר ובידול מקרופאגים בתרבות, זיהום במבחנה עם צורות זיהומיות (metacyclic promastigotes או amastigotes) של לישמניה , כימות מספר תאיים טפילים-בכל פרק זמן של 24 שעות ביממה לתקופה של 72-96 שעות בעקבות זיהום. נעשה שימוש assay הזה במעבדה שלנו כדי לקבוע את ההשפעה של מספר גורמים סביבתיים, טפיל גנים, כולל זיהוי של תפקיד קריטי של ברזל בקידום התקפה אלימה ל’ amazonensis היה עוד יותר לאימות על ידי לו טביעות רגל לימודי התפתחות הנגע עכברים^{6,8,9,10,11,12,13,14,15} . מאז כל המינים לישמניה פתוגניים לבסס את הנישה replicative שלהם בתוך המארח מקרופאגים, וזמינותו הזה יכול לשמש אוניברסלית האישושים התקפה אלימה על כל המינים לישמניה .

ביצוע BMM זיהומים מאפשר ניתוח אינטראקציות מארח-טפיל ברמה תא בודד, ובכך הבנה רחבה יותר של מה טפילים לישמניה לקיים אינטראקציה עם microenvironment מארח המועדפת שלהם, PVs של מקרופאגים. מקרופאג זיהום מבחני בהצלחה שנוצלו על ידי מספר קבוצות^{16,17,18,19,20,21,22} לחקור פונקציות הן מקרופאג מארח את גנים ספציפיים לישמניה , ואת מעורבותם פוטנציאליים הגומלין המורכבים המאפיינת את זיהום תאיים. זיהומים BMM לאפשר כימות של צמיחה טפיל כמו read-out ההשפעה של המארח גורמים המשפיעים על ההישרדות תאיים, כגון ייצור תחמוצת החנקן microbicidal, דור של מינים חמצן תגובתי, התנאים לוואי אחרים המערכת נתקלה בפנים PVs ליזוזום דמוי²³. מקרופאג זיהום מבחני גם כבר מנוצל כדי לזהות הפניות סמים אנטי-leishmanial פוטנציאליים עבור פיתוח טיפולית^13,24.

הטבע במבחנה של זיהומים BMM מספקת מספר יתרונות על פני שיטות אחרות כדי להעריך לישמניה התקפה אלימה. עם זאת, מספר מחקרים קודמים בחינת מנגנונים תאיים טפילים לשרוד לאורך זמן לא לכמת זיהום כמו בגודל^21,20,קצב²⁴. יתר על כן, מחקרים רבים התמקדו בעקבות זיהומים ויוו לאורך זמן עשו זאת על ידי מדידת גודל הנגע עורית וסימפטומים פיסיולוגיים אחרים הקשורים רק בעקיפין טפיל שכפול^{25,26 , 27}. in vivo זיהום היא גישה מחמירה כדי להעריך את הטפיל התקפה אלימה, אבל מדידות גודל הנגע על סמך לו טביעות רגל ונפיחות לבדו לעיתים לקוי, כפי הם משקפים את התגובה דלקתיים ברקמות נגוע ולא המספר המוחלט של טפילים. מסיבה זו, התפתחות הנגע לו טביעות רגל מבחני חייבת להיות מלווה כימות של עומס הטפיל ברקמות נגוע, תהליך שדורש דילול המגביל ממושך מבחני²⁸. בנוסף, מחקרים ויוו לעתים קרובות כרוך הקרבת בעלי חיים מרובים בנקודות שונות בזמן כדי לחלץ לרקמות של הריבית^{6,8,9,10, 11 , 13}. לעומת זאת, ניתן להשיג מספר רב של BMMs חיה אחת, תאים אלה יכול להיות מצופה בתנאים לאפשר הערכה של זיהום בנקודות שונות בזמן. יתר על כן, בהשוואה ל ויוו מחקרים, ביצוע במבחנה BMM זיהומים מאפשר שליטה רבה יותר על תנאי הניסוי. לכימות של מקרופאגים להידבק יחד עם טפילים עצמם מאפשר שליטה מדויקת של הריבוי של זיהום (MOI) ושל תרבות תנאים. שליטה טובה על גורמים אלה יכולים להיות מפתח לזיהוי מאפייני דיסקרטית מסלולים סלולר, להבין את השפעתם על מהלך של זיהום.

לאור יתרונות אלו, זה די מפתיע כי מעט מאוד קבוצות לימוד לישמניה התקפה אלימה כה מנצלים מלא הערכה כמותית של שכפול תאיים ב מקרופאגים. במאמר זה נדון מלכודות נפוצות עשוי להיות פוגעות ניצול נרחב יותר של זה וזמינותו, ומספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להקל על ביצועה נאות. בהתחשב הדיוק שלה ואת צדדיות, וזמינותו זיהום BMM שנתאר כאן יכול לא רק להיות מנוצל כדי לחקור את האינטראקציות פתוגן-פונדקאי המשפיעים על התקפה אלימה לישמניה , אלא גם ללמוד אחרים המיקרואורגניזמים לשכפל בתוך מקרופאגים²⁹. חשוב, זה וזמינותו יכולים גם להתפתח כשיטת הקרנת טרום קליניים מהיר וחסכוני עבור פיתוח תרופות אנטי-leishmanial.