عضلة رافعة أوريس التحضير لدراسة انتقال الأعصاب الثدييات المشبك في ظروف الجهد
Summary
يستخدم البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة عضلة عضلة رافعة أوريس (ال) الماوس لتسجيل عفوية وإمكانيات بوستسينابتيك أثارت العصبية (المشبك الحالية) والتيارات (الجهد-المشبك) عند تقاطع العصبية والعضلية. استخدام هذه التقنية يمكن أن توفر أفكاراً رئيسية في آليات انتقال متشابك في ظل الظروف العادية، والمرض.
Abstract
وصف هذا البروتوكول تقنية لتسجيل انتقال متشابك من الوصلات العصبية العضلية في ظل الظروف الحالية-المشبك والجهد-المشبك. يتم استخدام إعداد السابقين فيفو عضلة رافعة أوريس (ال) لأنها عضلة رقيقة ينص التصور سهلة للوصلات العصبية العضلية إيمباليمينت ميكروليكترودي في اندبلت موتور. يسمح هذا الأسلوب لتسجيل مصغرة تلقائية اندبلت إمكانات والتيارات (ميبس وميبكس)، وإمكانات اندبلت أثارت الأعصاب والتيارات (المنتجات المفضلة بيئياً وابكس)، فضلا عن خصائص الغشاء اندبلت موتور. النتائج التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب تضمين محتوى كانتال (QC)، عدد من مواقع إطلاق سراح حويصلة (n)، واحتمال الإفراج عن حويصلة (فrel)، وتيسير متشابك والاكتئاب، فضلا عن العضلات الغشاء وقت ثابت (τ م)، وإدخال المقاومة. يمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج الماوس من الأمراض البشرية تسليط الضوء على الأمراض الرئيسية في الحالات المرضية والمساعدة في تحديد استراتيجيات علاجية جديدة. بكامل الجهد-لقط المشبك واحد، يوفر هذا الأسلوب أحد التحليلات الأكثر تفصيلاً لانتقال متشابك المتاحة حاليا.
Introduction
دراسة انتقال متشابك في الوصلات العصبية العضلية يوفر نظرة ثاقبة العلاقة الديناميكية بين النظامين العضلي العصبي والهيكل العظمى وهو نموذج ممتاز لدراسة فسيولوجيا متشابك. عضلة رافعة أوريس (ال) عضلة رقيقة، مما يسمح للوصلات العصبية العضلية تصور بسهولة. ووصفت تقارير سابقة الراحة من استخدام ال دراسة متشابك المخدرات والسموم واتسمت خصائص نوع الألياف العضلية الهيكلية لل1،2. واستخدمت العديد من الدراسات ال دراسة فسيولوجيا الأعصاب3،4،5،6،،من78. للكهربية، القدرة على سهولة مراقبة الوصلات العصبية العضلية لل يسمح للموضع الدقيق من ميكرويليكتروديس في اندبلت موتور، ويقلل كثيرا من قضايا الفضاء المشبك في تسجيل انتقال متشابك. سهولة الحصول على تسجيلات المشبك الحالية من خصائص غشاء العضلات، مثل الغشاء وقت ثابت (τm) وإدخال المقاومة (آرفي). وعلاوة على ذلك، يمكن قياس هذه الخصائص من ألياف العضلات نفسها المستخدمة لتسجيل الإرسال العصبية العضلية، مما يسمح لمقارنة مباشرة لدالة متشابك لخصائص غشاء العضلات. تحليل هذه البيانات يمكن أن توفر أفكاراً رئيسية في الآليات الجسدية للعديد من الأمراض العصبية العضلية والدول تغيير النشاط.
أحد جوانب رئيسية للأسلوب الموصوفة هنا هو استخدام المشبك الجهد لتسجيلات متشابك، التي لا تخضع لغير linearities مصادفة في المشبك الحالية وهي مستقلة عن خصائص غشاء العضلات. مزايا استخدام المشبك الجهد مقابل المشبك الحالي لدراسة انتقال الأعصاب أنشئت بدور رائد في الجهود المبذولة في الخمسينات9. تحت المشبك الحالية، المنتجات المفضلة بيئياً التي تتجاوز 10-15 mV في السعة ليست نتاج خطية ل مشروعات السعة9. على سبيل المثال، إذا كانت مشروعات متوسط 1 أم، EPP 5 أم يمكن أن يفترض أن يكون نتاج 5 ميبس (مراقبة الجودة 5)؛ بينما، EPP 40 أم سيكون نتاج ميبس أكثر من 40. هذا غير الخطي في أكبر المنتجات المفضلة بيئياً يحدث بسبب قيادة القوة EPP، الذي هو الفرق بين إمكانات غشاء وإمكانات التوازن لمستقبلات أستيل (~-10 mV)، يقلل إلى حد كبير خلال بيئياً كبيرا. يتم تجنب هذه المسألة في تجارب المشبك الجهد لإمكانات غشاء العضلات لا يتغير أثناء تجارب المشبك الجهد. عيب أن تجارب المشبك الجهد أكثر صعوبة من الناحية التقنية الانتهاء من التسجيل الحالي-المشبك. مع هذا في الاعتبار، وضعت مكلوكلين ومارتن تصحيحًا رياضية مباشرة حسابات لغير linearities في تسجيلات المشبك الحالية من المنتجات المفضلة بيئياً10. التصويبات التي تعمل بشكل جيد11،،من1213، ولكن الأهم من ذلك، تفترض أن تعطلت لم خصائص غشاء العضلات.
خصائص غشاء العضلات ذات أهمية خاصة للنظر في حالة دراسة الأوضاع أو الحالات المرضية التي تعطل العضلات. على سبيل المثال، الهيكل العظمى والعضلات من طراز R6/2 المعدلة وراثيا لمرض هنتنغتون هايبريكسسيتابل بسبب تخفيض تدريجي في استراحة الكلوريد والبوتاسيوم التيارات14،15. نتيجة لذلك، تزداد ميبس والمنتجات المفضلة بيئياً في العضل R6/2. ومن المؤكد أن عوامل إضافية يمكن أن يغير ميبس والمنتجات المفضلة بيئياً. العمل مع نموذج مختلف من مرض هنتنغتون الفئران (R6/1) يتم العثور على تغييرات في المنتجات المفضلة بيئياً التي تبدو مرتبطة بالبروتينات الفخ8. لتقييم الآليات التي تسبب تغيير الإرسال العصبية العضلية، من المفيد للقضاء على آثار غشاء العضلات تغيير خصائص باستخدام المشبك التيار الكهربائي. في دراسة أجريت مؤخرا، تم درس الإرسال العصبية العضلية R6/2 في ظل الظروف الحالية والجهد المشبك كلا استخدام الأسلوب الموصوفة هنا. وكانت بأكملها اندبلاتيس موتور الجهد-فرضت مع أقل من 1% خطأ بوضع ميكروليكتروديس اثنين داخل ثابت طول اندبلت16. تبين أن الجهد-المشبك وتصحيح السجلات الحالية-المشبك أسفرت عن قياسات المتناقضة للإرسال العصبية العضلية في العضلات R6/2. هذا يسلط الضوء على أنه قد يكون من الصعب لتصحيح المنتجات المفضلة بيئياً لغير لينيريتيس إذا كان قد تم تغيير خصائص غشاء العضلات ويبين فوائد الحصول على سجلات الجهد-المشبك مستقلة عن خصائص غشاء العضلات. البروتوكول المعروضة هنا مثالية لدراسة الأوضاع أو الحالات المرضية التي تؤثر على انتقال متشابك وخصائص الغشاء بوستسينابتيك.
Protocol
Representative Results
Discussion
ووصف هنا هو إعداد واستخدام الماوس لل العضلات لقياس الإرسال العصبية العضلية في ظل الظروف الحالية أو الجهد المشبك. وهناك عدة نقاط هامة النظر لتشريح خارجاً ال. يمكن تنظيف النسيج الضام الزائدة من الإيدز العضلات في إيمباليمينت الكهربائي، كما الأقطاب عائقة النسيج الضام عند وضعها إيمباليمينت. ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور مارك م. الأغنياء ودانيال ميراندا لتعليقات تحريرية، أحمد خيدراكي للمساعدة في إنشاء هذا الأسلوب، وجامعة ولاية رأيت للدعم المالي (بدء تشغيل الصندوق إلى A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Referencias
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neurociencias. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neurociencias. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
