JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Published: April 20, 2018
doi:
10.3791/57479
,
1Cluster of excellence CellNetworks,Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

Summary

Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.

Abstract

Varolan benzeşme arıtma (AP) tamamlayacak protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlanması için yaklaşımlar, enzimler yakınlık bağımlı yaşayan hücrelerde proteinlerin etiketleme izin tanıttı. Bir tür enzim, BirA * (BioID yaklaşımda kullanılır), aracılık eder yaklaşık 10 tonluk bir içindeki proteinlerin biotinylation nm. Bu nedenle, faiz bir protein için erimiş ve hücrelerde ifade zaman, kendi doğal ortamlarında proksimal proteinler etiketlerine göre sağlar. Birleştirilmiş protein kompleksleri arıtma üzerinde dayanır AP aksine, BioID olursa olsun izole olduklarında olup olmadığı hala faiz protein ile etkileşim vardır hücrelerin içindeki işaretlenmiş proteinler algılar. Çünkü biotinylates proksimal proteinler, bir Ayrıca yararlanmak için çok verimli bir şekilde onları ayırmak biotin streptavidin olağanüstü benzeşme hakkında. BioID AP daha iyi tanımlayıcı geçici veya zayıf etkileşimler için yapar iken, her iki AP ve BioID kütle spektrometresi yaklaşım tüm olası etkileşim belirli bir protein olabilir genel bir bakış sağlar. Ancak, onlar her tanımlanan PPI içeriğine bilgi vermeyin. Gerçekten de, çoğu proteinler genellikle birkaç kompleksleri, farklı olgunlaşma adımları veya farklı işlevsel birimler için karşılık gelen bir parçasıdır. Her iki yöntem de bu ortak sınırlama adrese, BirA * enzim üzerinde dayalı bir protein parçaları uluslara tahlil mühendislik. Bu tahlil, iki etkin olmayan parçaları BirA * yakın hangi onlar erimiş iki etkileşen proteinler tarafından getirdiğinde etkin bir enzim içine yeniden monte. Elde edilen Böl-BioID tahlil böylece etkileşen proteinler bir çift bir araya proteinler etiketlerine göre sağlar. Bu iki yalnızca belirli bir bağlamda etkileşim sağlanan bölme-BioID onların yerel hücresel ortamlarında belirli içerik bağımlı işlevsel birimler analiz sonra sağlar. Burada, test etmek ve split-BioID etkileşen proteinler çiftine uygulanan adım adım bir protokol sağlar.

Introduction

En hücresel işlevler dinamik olarak makromoleküllerin kompleksleri araya proteinler tarafından gerçekleştirilen gibi protein-protein etkileşimleri (PPI) kimlik Biyomedikal Araştırma büyük bir çaba değildir. Nitekim, ÜFE kez hastalığında deregüle ve tedavi1için potansiyel hedefleri temsil eder. ÜFE tanımlaması benzeşme arıtma (AP) yaklaşım olan, için en yaygın yöntem kullanılan hücre lizis, ardından bir protein ilgi özellikle bir matris üzerinde saflaştırılmış ve ilişkili proteinler daha sonra kütle spektrometresi tarafından tespit (MS). AP-MS güçlü bir yaklaşım olmakla birlikte, bu genellikle de kötü çözünür protein kompleksleri, geçici çok etkileşimler veya sağlam bir hücre altı yapısı gerektiren PPI gerçekleştirmez. Ayrıca, tek bir protein genellikle birkaç farklı protein kompleksleri parçası olarak verilerin yorumlanması PPI ağlar, dinamik doğası gereği karmaşık.

BioID2 veya APEX23,4 gibi teknikleri yakınlık etiketleme son zamanlarda bazı AP-MS yaklaşımlar sınırlamaları gidermek üzere geliştirilmiştir. BioID içinde enzim BirA * (yabani tip e.coli enzimi G115R değişkenine karşılık gelen) değişken biotinyl-AMP ile Birincil aminler tepki verebilir (biyo-AMP) tromboksan. Biyo-AMFİ için aktif merkezini korur, vahşi türü enzim aksine BirA * biyo-AMP kendi Difüzyon komşu çevresi için izin serbest bırakır. Bu nedenle, faiz bir protein için erimiş ve hücrelerde ifade, proksimal proteinler 10 nm5tahmini bir yelpazesi içinde biotinylated olabilir. Bunlar işaretlenmiş proksimal proteinler sonra streptavidin açılan tarafından izole ve MS tarafından tanımlanan. AP-MS karşı BioID bir füzyon protein ifadesi gerektirir. Bu böylece sadece fonksiyonu etiketleyerek engel değil proteinler için uygulanabilir. Ayrıca, etiketleme hızı genellikle yavaş, 6-24 h2,6kısa ömürlü proteinlerin algılama zorlu yapma,. Henüz, AP-MS için karşılaştırıldığında, BioID-MS birkaç önemli avantajlar sunuyor: ilk, onun yakalar etkileşimleri kendi yerel hücresel ortamında; birleştirilmiş kompleksleri yerine ikinci, etiketli proteinler hücre lizis izole edilmiştir; Üçüncü olarak, streptavidin pulldowns denaturing arabellekleri ve sert çamaşır koşulları kullanarak izin veriyoruz. Bu nedenle, daha hassas geçici veya zayıf etkileşimler7 veya belirli bir ortaya etkileşimleri algılamaya ve hücre altı yapısı8yalıtmak zor yöntemidir.

Ancak, çoğu proteinler genellikle hücresel cues göre ya da yapılması gereken işlevine yeni model daha büyük kompleksler bir parçasıdır. Bu nedenle, tek bir protein genellikle birkaç kompleksleri, farklı işlevsel birimler için karşılık gelen, farklı içeren ve/veya ÜFE örtüşen bir parçasıdır. Her iki yaklaşımın tüm ilişkilendirmeleri verilen bir protein olabilir genel bir bakış vermek, ama onlar bireysel PPI bağlamında adrese başarısız. İkinci çözünürlüğü artırmak için biz bir protein parçaları uluslara tahlil (PCA) hangi iki etkin olmayan parçaları BirA * (NBirA * katalitik etki alanı içeren ve CBirA * yeniden etkinleştirme etki alanı olarak görüntülenebilir) olabilir tasarladık tekrar yakın iki tarafından getirdiğinde etkin bir enzim içine proteinler9etkileşim. Elde edilen Böl-BioID tahlil yakınlık bağımlı biotinylation etkileşen proteinler bir çift bir araya ve böylece bağlam kimliği bağımlı protein derlemeler sağlayan proteinler üzerinde odaklanır. Son zamanlarda iki ayrı protein kompleksleri miRNA-aracılı gen susturmak yolu9‘ dahil çözülerek Böl-BioID en iyi çözünürlük gücünü gösterdi.

Özet olarak, bir tek ve basit yöntemi, keşfetmek ve özellikle PPI içinde belirli bir protein dahil, karşılık gelen protein kompleksi ek bir etkileşen protein bilinen sağlanan tanımlanmış işlevsel birimleri için atama Böl-BioID sağlar.

Protocol

Not: Yöntem genel bakış şekil 1′ de gösterilmiştir. 1. klonlama stratejisi planlaması Test edilmesi için iki putatively etkileşen protein seçin.Not: Her iki proteinlerin Böl-BioID parçası için erimiş: NBirA * veya CBirA *. Bir negatif kontrol CBirA * füzyon protein ile NBirA * yeşil flüoresan protein için erimiş test edilecektir (NBirA *-GFP). Ek bir denetim NBirA * füzyon yalnız, soydaş CBirA * füzyon olmadan ya da birlikte bir CBirA * ilgisiz bir protein erimiş test edilebilir. CBirA * kullanmamanız önerilir-GFP olarak negatif kontrol olarak sürekli olarak herhangi bir NBirA * füzyon protein9′ a birleştirildiğinde büyük arka plan için gösterildi. Bu gözlem neden ifade düzeyini CBirA * olabilir-GFP, çok önemli reassociation NBirA * parçası ile yol açabilir kullandığımız şimdiye kadar herhangi bir diğer CBirA * füzyon proteinler daha yüksek. İki protein seçildikten sonra her ikisi de zaten başarıyla fonksiyonel çalışmalar (örneğin GFP öğesini füzyon protein) etiketli olup olmadığını bulmak için edebiyat kontrol edin. Bu tür çalışmalar varsa, etiket (, N – veya C-terminus) konumunu not ve aynı yönlendirme Böl-BioID parçalarıyla ilgi proteinler etiketlemek için kullanın. Böyle bir çalışma varsa, her iki proteinler için kodlama planı yapıları N – ve C-terminus adlı öğesini ve füzyon protein (örneğin, bir hücre satırı için WT protein tükenmiş bir kurtarma deneyi) işlevselliğini sınamak için bir tahlil planı.Not: uzun esnek halkalı kodlamak plazmid Şekil 2 ‘ de açıklanan kullanarak iki füzyon protein eşlerken, füzyon protein (BirA * parçaları akıntıya karşı erimiş veya ilgi proteinlerin aşağı akım) yönünü genellikle önemli değil . Gerçekten de FRB ve FKBP modeli proteinleri olarak kullanarak, o bu tüm was göstermek dört olası yinelemeler (N-termini, C-termini, N-terminus ve diğer C-terminus, hem de, her iki parçaları ve tersi) karşılaştırılabilir biotinylation9verim. Tasarım astar iki protein split-BioID plazmid klonlama için ilgi ORFs yükseltmek için. Dikkat edin çeviri çerçeveler BirA * parçaları ile aynı olduğunu. Şekil 2’ de açıklanan plazmid kullanıyorsanız, enzimleri PmeI ve PacI füzyon CBirA * ve NBirA * füzyon için ClaI ve MluI enzimler oluşturmak için kullanın.Not: Şekil 2 ‘ de tasvir plazmid F3/FRT rekombinasyon siteleri tarafından çevrili bir çift yönlü tet-yanıt veren öğe taşımak. Bu kabaca aynı plazmid10ve olasılığı hızla rekombinasyon aracılı kaset exchange (RMCE) tarafından istikrarlı hücre hatları oluşturmak için her iki füzyon proteinlerin aynı düzeyde düzenlenmiş ortak ifade sağlar. CBirA * bir bayrak etiketi olan bu Plasmid’ler NBirA * myc etiketi vardır, vardır. ORFs tabii da bünye rehberleri ile bireysel plazmid üzerinde kopyalanmış.Kritik adım: İki etkileşen protein sınarken, NBirA * protein 1 ile CBirA * protein 2 erimiş birlikte erimiş karşılaştırmak için tavsiye edilir ve NBirA * CBirA * 1 protein erimiş kombine protein 2 erimiş. Nitekim, bu sık sık bir yineleme diğer daha iyi çalıştığını görülmektedir. 2. ilgi genlerin ORFs Split-BioID plazmid klonlama Not: Bu örnekte, N-terminus adlı-ebilmek var olmak tagged iki protein olarak kabul edilir. Dört koşulları test ve sigara transfected hücrelere (Tablo 1) göre. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile uygun astar test edilecek iki proteinlerin ORFs yükseltmek için kullanın. ClaI ve MluI kısıtlama siteler için NBirA * füzyon protein ve CBirA * füzyon protein için PacI ve PmeI siteleri tanıtmak astar tasarım.Not: PCR ile herhangi bir ticari, tercihen proofreading, DNA polimeraz gerçekleştirilir. Standart protokol el kitabı izleyin ve astar erime sıcaklığı ve üretici yönergelerine göre kuvvetlendirilmesine ORF uzunluğu adapte. İlk ORF subclone Plazmid (yaklaşık 2 μg) ve (NBirA * erimiş için) ClaI ve MluI ile ORF1 PCR Güçlendirilmiş sindirmek. Sindirim reaksiyonları 1 μL toplam hacmi 1.5 mL tüp 37 ° C’de 1 h için 20 μL DNA ve reaksiyon arabellekte uygun hacmi ile karışık her enzim kullanarak gerçekleştirmek Her iki sindirim örnekleri üzerinde % 1’özel-TAE DNA jel çalıştırın. Sindirilir Plazmid ve ORF1 temiz neşter ve 1,5 mL tüpler aktarmak ile karşılık gelen grup tüketim. Standart bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak her iki grup arındırmak. Sindirilir Plazmid ve ORF1 ligate standart reaktifler kullanarak. Tüp ligasyonu seti kullanarak Malzeme tabloiçinde belirtilen, 100 ligate 3-5 saat molar aşırı eklemek üzerinden 4,5 μL toplam hacmi plazmid DNA içeren ng. 2 x T4 ligaz arabelleği 5 μL ve T4 DNA ligaz 0.5 μL ligasyonu Seti’nden ekleyin. (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için bir 1,5 mL tüp ligasyonu tepki gerçekleştirin. Standart DH-5α E. coli yetkili hücreleri (Inoue’nın yöntemi11göre hazırlanmış) dönüştürün. Tüp ligasyonu tepki Mix 3 μL 1,5 mL yetkili hücrelerinin 50 μL ile buzda tüp ve 30 dk. bir ısı hücrelere kümesi 42 ° c 30-45 s blok ve sonra geri 2 dk. eklemek 250 μL Önceden ısıtılmış (37 ° c) için buz üzerinde kuluçkaya Transfer için kuluçkaya lysogeny suyu (LB) orta ve plaka 100 μL hücre Önceden ısıtılmış (37 ° C) Ampisilin içeren LB-agar plaka üzerinde. Gecede 37 ° C’de hücreler kuluçkaya Ertesi gün dört ila altı kolonileri seç ve onları 37 ° C’de, 180 rpm kuluçkaya, 3 ml LB orta bir 15 mL tüp 100 μg⋅mL-1 Ampisilin içeren bir gecede. Standart DNA MiniPrep kit kullanarak çekilen kolonilerden plazmid yalıtmak. Kaset 2 ters astar (Tablo 2) kullanarak sıralama Sanger tarafından plazmid doğruluğunu doğrulamak. Bir kez ilk ORF içeren bir plazmid tespit edilmiştir, bu plazmid adım 2.2 olarak aynı adımları takip ama PmeI ve PacI enzimler kullanarak ikinci ORF subclone. Kaset 1 ters astar (Tablo 2) kullanarak elde edilen plazmid sıra. 3. test Fusion proteinlerin Not: Çift indüklenebilir ifade plazmid (Şekil 2) ve HeLa-11ht hücreleri, subclonal bir HeLa-CCL2 hücre kültürünü, stabil ters transkripsiyon tetrasiklin kontrollü harekete geçirmek rtTA-M2 ifade ve içeren için aşağıdaki yönergeler içindir bir Locus RMCE12. Dulbecco’nın modifiye kartal orta (% 10 tetrasiklin-Alerjik fetal sığır serum (FBS) içeren DMEM) bu hücreler için büyüme ortamıdır. Başka bir hücre tipi kullanırken, kesin tohumlama şartlar ve büyüme orta adapte gerekir. Geçici transfection Tohum hücreleri 1 x 105 bir konsantrasyon, iyi bir altı-şey plaka başına 2 ml transfection önceki gün hücreleri ve hücre gecede 37 ° C’de, % 5 CO2 hücre kültür kuluçka kuluçkaya. Transfection günü, her şey orta kaldırın ve taze orta 2 mL ile değiştirin. Dört transfection reaksiyonlar Tablo 1göre hazırlayın. Her şey transfect için plazmid DNA 1,5 mL steril tüp ve dolgu için 500 µL serum olmadan DMEM orta ile 3 µg polyethylenimine 6 µg ekleyin. Her şey için açılan bilge eklemeden önce her transfection karışımı oda sıcaklığında en az 5 min için kuluçkaya. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2hücreleri kuluçkaya. İndüksiyon ve yakınlık etiketleme Transfection, ertesi gün orta kaldırmak ve biotinylation uyarmak için 50 µM, biotin ve Doksisiklin füzyon proteinlerin ifade ikna etmek için 200 ng⋅mL−1 ile takıma orta yerine. En az 20 h 37 ° c, % 5 CO2için hücreleri kuluçkaya. Biotin hisse senedi bir çözüm sağlamak için 50 mg⋅mL-1 , biotin dağıtılması ( caiçin karşılık. 200 mM) 2 M amonyum hidroksit içinde. Tamamen çözülmüş bir kez 500 mm Hepes, pH 7.4, 50 mM için sulandırmak sonra HCl. Aliquot ile pH 7.4 için ayarlamak ve elde edilen 1000 x hisse senedi çözüm-20 ° C’de depolayın 10 mg⋅mL-1% 70 etanol içinde ve bir vidalı kapak microtube içinde belgili tanımlık karanlık-20 ° C’de deposunda Doksisiklin geçiyoruz. Hücre lysate hazırlık Bir kez soğuk (4 ° C’de) 1 fosfat tamponlu mL serum fizyolojik (PBS) içeren hücreleri yıkayın. Her şey için 100 µL lizis arabelleği (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, %0,5 NP-40, 0,5 mM DTT ve proteaz inhibitörleri) ekleyin. Hücreleri hücre kavgacı tip ve 1,5 mL tüpler aktarmak ile hasat. 14.000 x g 4 ° C’de hücre artıkları kaldırmak için 10 dk de örnekler santrifüj kapasitesi. Supernatants taze tüpler aktarmak ve Buza koyun. Bir Bradford tahlil tutarlarla protein belirlemek. SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) ve Western Blot SDS-polyacrylamide jel hazırlayın. İçin her lysate temizledin, SDS-yükleme arabelleği 30 µL toplam 30 µg (en az 15 µg) proteinin örnek bir sayfa hazırlamak. O zaman her örnek (20 µL/de) eşit miktarda SDS-polyacrylamide jel üzerinde yük ve Elektroforez için devam edin. Elektroforez sonra herhangi bir standart iletişim kuralı kullanılarak bir düşük Floresans PVDF leke membran için fraksiyonlara proteinler aktarın.Not: protein biotinylation analiz etmek için transfer hızlı bir “yüksek MW” programı ile 10 dk transfer süresi yarı kuru Western Blot aygıt genellikle iyi çalışıyor. Aktarımdan sonra PBS % 5 kuru sütte RT., 30 dk içinde membran engellemek Membran ile floresan streptavidin eşlenik seyreltilmiş 1:15,000 de %2 BSA ve %0,1 içeren PBS RT, 30-60 dk için kuluçkaya ara-20. Membran üç kez, her 10 min için %0,1 ara-20 ve sonra bir kez PBS ile daha fazlasını içeren PBS ile yıkayın. Membran Floresans tarayıcı görüntüleme sistemi üzerinde inceden inceye gözden geçirmek.Not: A tipik Western blot şekil 3üzerinde gösterilir. Yukarıdaki yordam floresan tabanlı algılama açıklar ama bir ışıldama tabanlı algılama HRP birleştiğinde streptavidin eşit derecede iyi çalışıyor. 4. proteomik çalışmaları için Split-BioID Önemli Not: Son kitle spektrometrik analizi için tüm aşağıdaki adımları keratin-Alerjik koşullarda gerçekleştirilmesi için tüm malzeme ve Kimyasalları gibi keratin-olabildiğince ücretsiz olmalıdır. Geçici transfection Transfection, önceki gün 3-4 10 cm tabak bir konsantrasyon 8 x 105 hücre plaka başına 10 ml, her koşul için tohum ve gecede, 37 ° C, % 5 CO2 hücre kültür kuluçka hücreleri kuluçkaya. Ertesi gün, her transfection koşul için bir ana transfection karışım hazırlamak: koşul başına üç tabak için polyethylenimine 36 µg ve plazmid DNA 18 µg çözünmüş 900 µL serum serbest DMEM. Her ana karışım en az 5 dk RT. az için kuluçkaya Bu arada, her yemeğin orta ile taze orta yerine ve 300 µL her plakasına bilge transfection karışımlar damla ekleyin. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2hücreleri kuluçkaya. İndüksiyon ve yakınlık etiketleme Transfection, ertesi gün 15 cm yemekleri hücreleri aktarın. Her yemek için orta kaldırmak, PBS 7 mL hücrelerle yıkama, 1,5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve resuspend hücreleri ve hücre süspansiyon büyüme orta 20 mL ile dolu bir 15 cm çanak transfer için büyüme orta RT. eklemek 3,5 mL, 5 min için kuluçkaya biotinylation uyarmak için 50 µM, biotin ve füzyon proteinlerin ifade ikna etmek için 200 ng⋅mL– 1 (son konsantrasyonları), doksisiklin ile takıma. En az 20 h 37 ° c, % 5 CO2için hücreleri kuluçkaya. Hasat ve depolama hücre PBS, iki kez hücrelerle yıkayın sonra PBS 1,5 mL her plakasına ekleyin ve hücreleri bir kavgacı tip ile hasat. 15 mL tüp bir durumuna karşılık gelen hasat hücreleri aktarmak ve bunları Santrifüjü 1200 x g, 5 dk, 4 ° c tarafından hasat Supernatants kaldırmak ve ek dondurma granül sıvı azot, o zaman mağaza 80 ° C’de daha fazla işleme kadar.Not: Alternatif olarak, hücre Ayrıca trypsinization tarafından müstakil, büyüme aracı olarak hasat, 15 mL tüp transfer ve PBS ile üç zaman donma önce yıkanır. Hücre lysates hazırlanması 10-20 kez hücreleri hücre topakları lizis arabellek (50 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, %0,4 SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 x tam proteaz inhibitörü) RT. Pass, 1 ml resuspend (5-10 vuruş) 25 G iğne ile. Örnekleri sonification algılama aygıtla solüsyon içeren temizleyicide.Not: Aşağıdaki programı Malzemeler tabloiçinde belirtilen sonification algılama cihazı ile kullanılabilir: dört döngüsü sırasında yüksek yoğunluklu, 30 s (4 ° C) soğuk döngüsünde başına su banyosu. Diğer sonification algılama cihazlarla uygundur ancak parametreleri buna göre ayarlanması gerekebilir. Triton X-100 için kurtarılan sonicated % 2 son bir konsantrasyon ulaşmak için lysate Ekle (genellikle, 100 μL Ekle % 20’si için 900 μL Triton X-100 hücre lysate sonicated) ve sonra 2.3 mL 50 mm Tris, pH 7,4 başına b önce 150 mm NaCl toplama ayarlamak için lysate 1 mL = streptavidin birleştiğinde boncuk için inding.Önemli Not: Yüksek tuz konsantrasyonları kez daha az verimli bağlama boncuklar için neden. 1.5 mL tüpler içinde ayarlanan lysates dağıtmak (ca. üç tüpler 1.1 mL) ve onları 16.000 x g, 10 min, 4 ° c, santrifüj kapasitesi Supernatants transfer (ca. 3.2 mL) 15 mL tüp ve tutmak 50-100 μL giriş malzeme olarak. Her örnek bir Bradford tahlil ile konsantrasyon ölçmek ve 3-3.5 mg protein içeriği denk streptavidin açılan için kullanın. Streptavidin açılanNot: Açılan yordama genel bir bakış şekil 4üzerinde gösterilir. Roux ve meslektaşları2tarafından yayınlanan özgün iletişim kuralını hemen hemen aynısı. Açılan yapılır, ilk kez örnekleri ile akışı ve yıkama 1 – 4 bir kenara Western blot analizi sağlamak koymak olabilir düzgün çalıştı prosedür (şekil 5). Her koşul için bir 1,5 mL tüp manyetik boncuklar streptavidin birleştiğinde süspansiyon, 200 μL aktarın. Tüpler bir manyetik raf yerleştirin, boncuk tüpler tarafına sopa kadar bekleyin (ca. 1 dk) ve depolama arabellek kaldırın. Boncuk hafifçe denge arabellek (50 mM Tris pH 7 – 4, 150 mM NaCl, %0.05 Triton X-100 ve 1 mM DTT) 1 mL ile karıştırılarak yıkayın. Dengelenmiş boncuk (genellikle 3-3.5 mg protein ile içerik, her durum lysates 2-4 1.5 mL tüpler içinde sevk başlatırken) tüpler ve yer gerekli sayıda eşit miktarda manyetik raf üzerinde geri gönderin. Denge arabellek kaldırmak ve her dizi boncuk karşılık gelen hücre lysates adım 4.4.7 eşit miktarda resuspend. Gecede 4 ° c dönen bir tekerlek üzerinde kuluçkaya. Ertesi gün 1,5 mL tüpler bir manyetik raf yerleştirin, boncuk tüpler tarafına sopa ve supernatants akışı aracılığıyla etiketli bir 15 mL tüp transfer kadar bekleyin.Not: Şu andan itibaren tüm belgili tanımlık merdiven oda sıcaklığında aksi belirtilmedikçe gerçekleşir. Yıkama arabelleği 1 (suda % 2 SDS) 200 μL her boru boncuk resuspend ve resuspended boncuk 1,5 mL tüpler bir durumuna karşılık gelen her kümesi birleştirir. Boncuk 8 dk için iki kere üstünde a dönme tekerlek yıkama arabelleği 1 1 mL ile yıkayın. Boncuk 8 dk için iki kez bir rotasyon tekerlek yıkama arabelleğinin 2 1 mL ile yıkayın (50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, % 1 Triton X-100 ve %0.1 Na-deoxycholate). Boncuk 8 dk için iki kez bir rotasyon tekerlek yıkama tampon 3 1 mL ile yıkayın (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, % 0.5 NP-40 ve %0,5 Na-deoxycholate). Boncuk 8 dk için iki kez bir rotasyon tekerlek yıkama arabellek 4 1 mL ile yıkayın (50 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl, % 0,1 NP-40). Son yıkadıktan sonra adım yıkama arabellek tümüyle kaldırılır emin olmak için çoğu süpernatant kaldırın ve sonra örnekleri spin. Manyetik rafa koymak onları, boncuk tüpler tarafına sopa ve sonra kalan arabellek kaldırmak kadar bekleyin. 30 μL elüsyon arabelleği ekleyin (10 mM Tris pH 7.4, % 2 SDS, %5 β-mercaptoethanol ve 2 mM Biotin) Boncuk için. 15 dakika 98 ° C’de kuluçkaya, sonra hemen bir manyetik raf üstündeki kaldırın. Eluted örnek bir taze tüp ve mağaza-20 ° C’de daha fazla işleme kadar aktarın. SDS-sayfa ve Western BlotNot: önce kütle spektrometresi analizi, biotinylation ve açılan başarısını değerlendirmek için SDS-sayfa ve Western blot tarafından önerilir. Hiçbir biotinylation desen bir düşünebilirsiniz gözlem yapılırsa dox veya biotin Orta olarak eklenmedi veya iki hisse senedi çözüm birinin bulunmadığından. Her giriş örneği için örnek sayfa 28 μL toplam 3 x SDS-yükleme arabellekte uygun hacmi ile protein örnek eşit miktarda karıştırılarak hazır olun. Sayfa örnekleri 3 x SDS-yükleme arabellek 2.5 µL ile her elüsyon örneğinin 5 µL karıştırarak hazırlayın. SDS-polyacrylamide jel üzerinde örnekleri (25 µL/iyi için girdileri, elüsyon örnekleri için 7 µL/iyi) yükleyin. Elektroforez ve Western Blot 3.4 bölümünde açıklandığı gibi devam edin. Açılan ilk kez performans, sayfa örnekleri (giriş, akış, yıkama 1 – 4, elüsyon) açılan her adımı için her örneğinin (giriş, akış, yıkama 1-4) 3 x SDS-yükleme arabellek veya 5 µL (elüsyon) 2.5 µL 3 ile 10 µL ile 20 µL karıştırılarak hazırlamanız x S DS-yükleme tampon ve adım gibi 4.6.4 (şekil 5) devam etmek. SDS-sayfa MS analizi içinNot: potansiyel keratin kirlenme en aza indirmek için prekast jelleri ve ticari örnek yükleme arabellek kullanılabilir. 4 x örnek arabelleği 6.25 μL her elüsyon örnek 18.75 μL için eklemek ve onlar jel 2-3 cm göç kadar örnekleri prekast % 4-20 SDS-jel üzerinde çalıştırın. 13 ‘ te 15 cm petri kabına boyama jel ile kolloidal Coomassie parlak mavi G250 leke. Temiz bir neşter (ca. 17 kDa, şekil 6çalıştıran), streptavidin grubu hariç her örnek için tüm yolları tüketim ve eksize bantları 1,5 mL tüpler için aktarmak için kullanın. Bu örnekler proteomik tesisi daha fazla çözümleme için gönderin.Not: Tipik MS sonuçları referans 9 (şekil 3 ve Şekil 7ve ek tablolar) görülebilir. Tüm veri kümeleri gurur depo (katılım numarası PXD005005) kullanılabilir.

Representative Results

Nasıl bu yöntem inşaat Ago2, proteinlerin açık okuma çerçevesi (ORFs) göstermek için TNRC6C ve Dicer (tüm yolu susturmak miRNA-aracılı gen içinde karıştırmak) Böl-BioID plazmid klonlanmış. Ago2 çeviri represses bir miRNA-induced silencing kompleksi içinde (miRISC) TNRC6C ile etkileşim ve hedef mRNA’ların14çürüme teşvik olduğu bilinmektedir. MiRISC, Ago2 birleştirmek için baş rahip Dicer, içinde miRNA15ile dolu bir kompleksi içinde olgun miRNAs üreten enzim ile etkileşim. Bu nedenle Böl-BioID Ago2/Dicer çifti veya Ago2/TNRC6C çift uygulandı. İçin her çifti test edilmiş proteinlerin Ago2 ya NBirA * veya CBirA * bizim split-BioID plazmid (Şekil 2) kullanarak için erimiş ve Dicer ve TNRC6C için karşılık gelen soydaş BirA * parçası oldu. Buna ek olarak, her protein CBirA * erimiş ve bir NBirA * ile eşleştirilmiş-GFP füzyon olarak bir negatif kontrol. Bu test protein (Tablo 1) birbirine çiftinin dört yinelemenin test sonuçlar. Böl-BioID test edilmiş proteinlerin çifti etkileşim aktif olup olmadığını sınamak için şekil 1′ de tasvir düzeni takip ettik. Plazmid geçici bir tet-sistem uyumlu HeLa hücre kültürünü transfected. Ifade füzyon proteinlerin Doksisiklin (dox) ile indüklenen ve biotinylation aşırı biotin büyüme ortamına ekleyerek teşvik. 20 h kuluçka ile bir süre dox ve biotin, hücreleri lysed ve biotinylated proteinler algılamaya konjuge streptavidin kullanarak Western Blot tarafından analiz edilebilir. Memeli hücrelerinde iki büyük grup genellikle konjuge streptavidin untransfected örnek (şekil 3, yıldız) tarafından algılanır ve endogenously biotinylated proteinler (en büyük olasılıkla mitokondrial karboksilaz) karşılık gelir. Bu iki grup tüm örneklerinde bulunması ve uygun iç yükleme denetimi olarak kullanılabilir, bu nedenle eşit protein miktarları yüklenmesini denetlemek için bir temizlik protein tespiti yersiz olur. Tipik bir BioID/Böl-BioID deney, gözlenen ek büyük gruplar kendi biotinylated var füzyon proteinlerdir. Diğer bir biotinylated protein görüldüğünde bile biotinylation füzyon proteinlerin zaten bu aşamada tespit iki test protein hücrelerde etkileşim gösterir. Şekil 3üzerinde tasvir deneyde, bu bir NBirA * olan belli ki-CBirA * TNRC6C veya Dicer füzyon ile eşleştirilmiş Ago2 füzyon proteinidir hangi CBirA ters kombinasyonları daha verimli-Ago2 diğer iki NBirA * füzyon için eşleştirilmiş proteinler (şekil 3, üst paneli, Kulvar 6-7 için 2-3 hatlarının yoğunluklarda karşılaştırın). Ayrıca, belgili tanımlık harekete geçirmek CBirA * füzyon hiçbiri NBirA * etkinleştirmek gibi belirli-GFP denetim füzyon protein kayda değer düzeyde (şekil 3, Karşılaştır şeritli 1, 4-5 untransfected hücrelere karşılık gelen lane 8). Bizim plazmid içinde NBirA * myc etiket ve CBirA * bir bayrak etiket (Şekil 2) vardır beri her füzyon protein ifade seviyede bu iki etiket (şekil 3, alt paneli) karşı antikor ile analiz edilebilir. Etkileşim kaynaklı biotinylation gözlenen deney ölçeklendirilebilir ve biotinylated proteinler streptavidin birleştiğinde boncuk Protokolü (şekil 4) 4 paragrafta belirtildiği şekilde izole. Yalıtım ilk kez gerçekleştirilirken, tüm belgili tanımlık merdiven arıtma Western Blot (şekil 5tarafından) analiz. Genellikle, boncuk bağlama-meli var olmak neredeyse nicel ve hemen hemen hiçbir sızıntı yoluyla yıkar dikkat edilmelidir. Önce işleme örnekleri için kütle spektrometresi, indüklenen biotinylation beklendiği gibi çalıştı ve füzyon protein ifade edildi emin olmak için bir Western blot çalışan öneririz. Ya zavallı transfection verimlilik veya hatalı dox indüksiyon nedeniyle ifade füzyon proteinlerin eksikliğidir. Füzyon protein ifade edildi ancak hiçbir biotinylation gözlenen, aşırı biotin (50 mikron) aslında Orta olarak eklendi ve hisse senedi biotin hala etkin olduğunu denetleyin. Eluted malzeme üzerinde bir protein Coomassie lekeli jel (şekil 6), tipik olarak analiz edilir zaman, uyması gereken en güçlü grup yaklaşık 17 kDa çalışır ve monomeric streptavidin karşılık gelir. Endojen biotinylated proteinler ve füzyon protein karşılık gelen bantları da gözlenen. Biz genellikle streptavidin grup yükleme iyi (şekil 6) kadar yukarıda örnek lane alan tüketim. Eksize grubun bir 1,5 mL tüp içinde saklanır ve bir kütle spektrometresi tesisine gönderilir. Alternatif olarak, ilişkili proteinler de streptavidin birleştiğinde boncuk tripsin sindirmek olabilir ve eluted sindirilmiş peptidler sütun oluşturur. Biz düzenli olarak kullanın (çoğunlukla varsayılan parametrelerini kullanarak başvuru 9 tipik MS sonuçları ve daha fazla bilgi için bkz: lizin biotinylation mümkün translasyonel modifikasyon ekleme,) MaxQuant yazılım ve16 MS ham veri analiz etmek ve Perseus suite17 sonraki istatistiksel analiz için her ikisi de özgür yazılım olan. Örnekler genellikle üç biyolojik çoğaltır çalıştırılır. Etiket içermeyen miktar kullanarak, özel olarak zenginleştirilmiş proteinler denetim koşulları üzerinde tespit edilebilir. Endogenously biotinylated proteinleri ve özellikle sigara BirA * enzim tarafından etiketlenir proteinler için filtre uygulamak için yalnızca önemli ölçüde üzerinde sayısı altı ilgisiz proteinler ile oluşturulan altı veri kümesinden gelen zenginleştirilmiş proteinler düşünün. Buna ek olarak, biz sadece üzerinde bir split-BioID veri kümesi içinde NBirA * füzyon protein yerini almış NBirA * tarafından zenginleştirilmiş sayısı düşünün-GFP. Diğer veri analizi stratejileri özellikle hücre kültürü (SILAC) kantitatif proteomik18amino asitleri ile kararlı izotop etiketleme kullanarak önerilmiştir. Ayrıca, çeşitli stratejileri biotinylated peptidler organik çözücüler19 veya biotin özgü kullanarak özel elüsyon koşullar biotin18, zayıflamış benzeşimli bir streptavidin değişken kullanarak doğrudan yalıtımı için tarif var antikorlar20,21. Mutlaka daha fazla protein keşfi için önde gelen, biotinylation siteleri tanımlaması Ekle sayısı belirgin olarak daha fazla güven ve yararlı ne zaman bir etkileşim topolojisinin ele alıyor. Şekil 1: split-BioID yordam bakış. Protein 1 protein 2 karmaşık bir parçası olarak ya da protein 3 karmaşık B. parçası olarak etkileşim kurar Özellikle karmaşık a kompozisyon soruşturma için protein 1 ve 2 Böl-BioID uygulanabilir. Kütle Spektrometre fotoğrafı bir Creative Commons Attribution-Share Alike 3,0 dağıtıma açıktır lisansı altında ve https://commons.wikimedia.org ThermoScientificOrbitrapElite.JPG dosya adı ile indirilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: split-BioID plazmid ifade kasetleri. Biz NBirA * ve CBirA * füzyon protein tüm kombinasyonları test izin vermek için dört plazmid sağlar. Plazmid ve tam haritalar addgene.org belirtilen numaraları altında bulabilirsiniz. Plazmid tet-yanıt veren öğe (7 x tetO) ve tet ifade sistemi ile uyumlu bir hücre satır kullanılmak üzere gerekir. Ayrıca tüm plazmid FRB ve FKBP ORFs NBirA * erimiş ve parçaları CBirA * sırasıyla dikkat edin. Sadece rapamycin varlığında bu iki protein etkileşim ve bu nedenle plazmid sistemi bu kimyasal9içinde hızlı bir şekilde test için kullanılabilir. Belirtilen kısıtlama benzersiz sitelerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 3: bir split-BioID deneme için tipik Western blot. Üst paneli: biotinylated proteinler fluorescently etiketli streptavidin ile tespiti. Alt paneli: Anti-Myc ve anti-bayrak antikorları ile füzyon proteinlerin algılama. İki çift proteinlerin test edildi: Ago2/TNRC6C ve Ago2/Dicer. Yolları 2 & 3, Ago2 CBirA * parçası için eklenen. Yolları 6 & 7, Ago2 NBirA * parçası için eklenen. Önemli sinyal yok ne zaman herhangi üç proteinlerin NBirA * ile kombine edilmiştir gözlendi-GFP (şerit 1, 4-5). Yıldızlar endogenously iç yükleme denetimi olarak hizmet verebilir biotinylated proteinler karşılık gelen grupları gösterir. Bu rakam Schopp vd. şekil 5B adapte 9 bir Creative Commons Attribution 4.0 uluslararası lisansı altında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: streptavidin açılan yordama genel bakış. Kütle spektrometresi analiz için biotinylated proteinlerin yalıtım için önemli adımlar tasvir edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: tipik Western blot streptavidin açılan deneme için. Eşit hacimli belirtilen her örnek üzerinde bir SDS-polyacrylamide jel dolu. Western Blot takiben biotinylated proteinler HRP birleştiğinde streptavidin ile tespit edildi. NBirA * karşılık gelen bantları-TNRC6C ve CBirA *-Ago2 belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: kütle spektrometresi analiz için tipik Coomassie lekeli protein jel. Streptavidin birleştiğinde boncuk eluted örnekten prekast protein jel üzerinde yüklü ve örnek göç kadar 2-3 cm çalıştırın. 17 kDa görülen büyük grubudur streptavidin. Hemen üstüne o grup alanı eksize ve kütle spektrometresi tesisine gönderdi. NBirA * karşılık gelen bantları-TNRC6C ve CBirA *-Ago2 belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Transfection örnek Test durumu 1 NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2 2 CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2 3 NBirA *-GFP / CBirA *-protein1 4 NBirA *-GFP / CBirA *-protein2 5 yok transfection Tablo 1: Split-BioID için iki protein uygularken koşullar genellikle test edilmiştir. Sıralama astar sıra Kaset 1 ters astar (CBirA füzyon) TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC Kaset 2 ters astar (NBirA füzyon) GTGGTTTGTCCAAACTCATC Tablo 2: astar için split-BioID plazmid sıralanıyor.

Discussion

Seviyelendirilmiş yordamı genler ilgi Böl-BioID clone Plazmidler, etkileşim kaynaklı biotinylation için test edileceğini ve kütle spektrometresi analiz için biotinylated proteinler yalıtmak nasıl açıklar. Biz burada geçici transfection dayalı bir açıklayınız. Ifade füzyon proteinlerin Orta olarak eklendi dox miktarına göre ayarlanmış olsa da, geçici transfection fena halde endojen için karşılaştırıldığında füzyon protein overexpress bazı hücreler homojen olmayan protein ifadeyle neden olabilir meslektaşları. Bu distorsiyonları karşılık gelen interactomes ve sadakatle endojen protein içeren etkileşimlerin yansıtmıyor PPI neden olabilir. Böylece Böl-BioID ile geçici sistem kurulduktan sonra istikrarlı hücre hatları oluşturmak için genellikle tavsiye edilir. Plazmid Flp aracılı rekombinasyon sistemi ile uyumlu ve faiz aynı tet-yanıt veren öğe düzenleme altında her iki genler yer. Gerekirse ve uyumlu memeli hücreleri ile kullanıldığında, onlar istikrarlı indüklenebilir hücre hatları kolay oluşturulmasına olanak sağlar. Örneğin, rtTA transkripsiyon tetrasiklin-harekete geçirmek harekete geçirmek ve benzersiz bir targetable genomik locus tetrasiklin-aracılı gen ekspresyonu sıkıca düzenlenmiş12olabilen ifade HeLa-EM2-11 satırını kullanın. Bu hücre kültürünü ve Flp aracılı rekombinasyon kullanarak, tek bir kopyasını transgene içeren istikrarlı hücre hatları iki-üç hafta içinde elde edilebilir. Alternatif olarak, bir de yerel genomik loci ilgi genlerin içinde BirA * parçaları tanıtmak için geçerli genom düzenleme teknikleri kullanabilirsiniz.

Bir protein etiketleme dayanır herhangi bir tahlil olduğu gibi bir sonuç füzyon protein fonksiyonel olup olmadığını düşünün gerekir. Kullanılabilir veri hangi faiz proteinler (örneğin için çalışmalar düşsel GFP) takip ve işlevsel test yararlıdır BirA * parçaları olmalıdır karar için yukarı veya aşağı faiz genler klonlanmış. Böyle bir veri yoksa, bir N-ölümcül sınamanız gerekir veya C-ölümcül öğesini proteinler işlevsel bir tahlil. Örneğin, füzyon proteinlerin etkinlik içinde endojen protein edilmiş çaldı-out ve vahşi türü duruma kıyasla bir hücre kültürünü test edilebilir. Proteinler ilgi her iki N ve C terminali Etiketler hoş görürsen, her ikisi de test edilmelidir. Gerçekten de, BioID deneylerde füzyon protein yönünü22etiketleme verimliliğini etkileyebilir. Böl-BioID protein bir çift için uygulamak, hangi iki proteinlerin ya NBirA * için eklenir veya CBirA * parçalara ayırması da etkisi9etiketleme verimliliğini biz bu Ayrıca, gözlemledim. Böl-BioID plazmid 16 amino asit uzun glisin/zengin bağlayıcı proteinler ilgi BirA * parçaları için kaplin başka bir PCA23 almış ve bizim için tüm etkileşen proteinler için çalıştı serin defa test ettik. Ancak, bir bazı protein çiftleri daha kısa veya daha uzun halkalı ile daha iyi işe yarayabilecek düşünmelisiniz. Son Not başka bir tahlil Bollen grup24tarafından tanımlanmıştır. Bu tahlil, BirA * bizimkinden (E256/G257) başka bir yerinde (E140/Q141) ayrılmıştır. Biz her iki Böl-BioID tatlar-yan yana test ve E256/G257, bu protokol için açıklanan iki etkileşen protein birleştiğinde daha güçlü yeniden etkinleştirme yol açar bulunan9.

Bu yöntemin bir dezavantajı genel etiketleme yavaş hızıdır. Tipik olarak, 6-24 h kuluçka biotin zamanla kayda değer biotinylation6protein kompleksleri dinamik modelleme eğitimi için bu tekniğin kullanımı engellemek, elde etmek gereklidir. İki protein etkileşim kurulduğunda sadece aktif olarak bu tahlil kısmen bu bilmeniz gereken adresleri ise çok dinamik süreçler için ya da kısa ömürlü proteinlerin analiz etmek için çalışmak için kullanımı engel etiketleme yavaş hızı. Mühendislik peroksidaz APEX2 1 dk3içinde proksimal proteinlerin verimli etiketleme teşvik bilinmektedir. APEX2 üzerinde dayalı bir PCA böylece BioID kaynaklı deneyleri yavaş etiketleme hız sınırlamaları adresi. Bir kanıt prensibi çalışma böyle bir split-APEX2 tahlil25nitelendirdi. Bir homodimerizing protein başarıyla biotinylated olsa da, ancak, tahlil de etiket ve etkileşen proteinler bir çift bir araya proteinler tanımlamak için kullanılıp kullanılamayacağı göstermiş kalmaya devam eder. Son zamanlarda, yönlendirilmiş evrim TurboID ve miniTurbo, 10 dk26aşağı daha kısa etiketleme zaman windows sağlayan iki çeşidini BirA * gelişmiş aktivite ile oluşturmak için kullanılan. Böl-BioID bu yeni çeşitleri için adapte uygulamaların daha geniş bir alana bu tekniğin kullanımı daha da uzatır.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmalar Alman Araştırma Konseyi (DFG) Alman mükemmellik girişimi (CellNetworks DFG-hariç 81) ve SFB638 ortak araştırma merkezi tarafından kısmi bir finansman yoluyla destekleriyle gerçekleştirilmiştir.

Materials

Acetic acid (glacial) VWR 20104.298 To make TAE buffer
Agarose Sigma A9539 Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction
Ammonia solution 25% NH3 Bernd Kraft 6012 To dissolve biotin
Ampicillin Sigma A9518 To select transformed bacteria
Bioruptor plus sonification device Diagenode B01020001 Other sonification devices are also ok
Biotin Sigma B4639 To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation
Bovine serum albumin fraction V Carl Roth 8076 Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays
Bradford Ultra reagent Expedeon BFU05L Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents
Cell scrappers TPP 99002 Any other model is also fine
ClaI New England Biolabs R0197 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
DMEM medium Sigma D6046 If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium
DNA miniprep kit Sigma PLN350 Any other kit is also fine
Doxycycline Applichem A2951 Dox is light sensitive
DTT Applichem A2948 Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh
DyLight 680-conjugated streptavidin Thermo scientific 21848 to use with a LiCor Western blot scanning device
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65002 The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)
EDTA Applichem A5097 Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder
Ethanol Sigma 32205 Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Any other kit is also fine
HCl 37% Merck 1.00317.1000 To adjust pH of biotin stock solution
HEPES Carl Roth 6763 Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm Millipore IPFL00010 This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device
LiCl Grüssing GmbH 12083 Make a 5M stock solution
Odyssey CLx imaging system LI-COR N/A To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody
Linear polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-2 Any other transfection reagent is also fine
Milk powder Carl Roth T145 To block Western blot membranes
MluI-HF New England Biolabs R3198 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
Na-deoxycholate Sigma 30970 Make a 10% (w/v) stock solution
NaCl Sigma 31434 Make a 5M stock solution
NP-40 (Nonidet P40 substitute) Sigma 74385 Make a 20% (v/v) stock solution
PacI New England Biolabs R0547 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Phosphate buffer saline (PBS) Sigma 806552 To wash cells before scrapping
PmeI New England Biolabs R0560 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001 Added to the lysis buffer to prevent protein degradation
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP Addgene 90003 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90004 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP Addgene 90008 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90009 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
Q5 High-Fidelity PCR kit New England Biolabs E0555S To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.
Quick ligation kit New England Biolabs M2200S To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.
RunBlue 4-20% SDS precast gels Expedeon BCG42012 To use when running samples for MS analysis
RunBlue LDS Sample Buffer Expedeon NXB31010 Running buffer for the RunBlue precast gels
SDS Sigma 5030 Comes as a 20% stock solution
tet-free serum Biowest S181T we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins
Trans-Blot Turbo Transfer system Bio-Rad 1704150 High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine
Tris Carl Roth 4855 Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)
Triton X-100 Applichem A4975 Make a 20% (v/v) stock solution
Tween-20 Carl Roth 9127 Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge. Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).
  2. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  3. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  4. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).
  6. Kim, D. I., et al. An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling. Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).
  7. Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes. J Proteomics. 118, 81-94 (2015).
  8. Morriswood, B., et al. Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation. Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).
  9. Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, (2017).
  10. Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells. EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).
  11. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  12. Weidenfeld, I., et al. Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci. Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).
  13. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
  14. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).
  15. MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).
  16. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  18. Opitz, N., et al. Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast. Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).
  19. Mackmull, M. T., et al. Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity. Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).
  20. Kim, D. I., et al. BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation. J Proteome Res. , (2017).
  21. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  22. Chapat, C., et al. Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs. P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).
  23. Luker, K. E., et al. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  24. De Munter, S., et al. Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions. FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).
  25. Xue, M., et al. Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells. Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).
  26. Branon, T. C., et al. Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms. bioRxiv. , (2017).

Tags

Split-BioIDProteomic AnalysisProtein ComplexesNative Cellular EnvironmentProtein Fragment Complementation AssayProximity-dependent Protein BiotinylationCell BiologyMass Spectrometric AnalysisStreptavidin PulldownProtein Complexes RemodelingContext-specific Protein Complexes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Schopp, I. M., Béthune, J. Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment. J. Vis. Exp. (134), e57479, doi:10.3791/57479 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image