Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Inflammasome-gemedieerde ontsteking is een essentieel onderdeel van de verdediging tegen pathogene organismen¹, maar ook ten grondslag ligt aan de etiologie van vele ziekten². De inflammatoire respons voor een groot aantal infecties wordt geactiveerd door cytosolische opsporing van pathogen verbonden moleculaire patronen (PAMPs) of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs). Patroon erkenning receptoren (PRR), met inbegrip van leden van de familie van de knik-achtige receptor (NLR), oligomerize na de detectie van deze PAMPs en DAMPs. Dit veroorzaakt de vorming van een multi eiwit complex genoemd de inflammasome, waarin de PRR, de adapter proteïne Apoptosis-geassocieerde speck-achtige eiwitten met een C-terminal caspase-recruitment domein (kaart) (ASC), en de Pro-vorm van caspase-1^3,4. Dit complex staat nabijheid-geïnduceerde auto-activering van caspase-1. Actieve caspase-1 leidt vervolgens tot een reeks van gebeurtenissen die karakteristiek voor de inflammatoire cel dood traject pyroptosis zijn. Deze gebeurtenissen omvatten: het splijten en de introductie van de inflammatoire cytokines IL-1β en de IL-18, lysosoom exocytose met introductie van lysosomale inhoud in de extracellulaire ruimte, nucleaire condensatie en gasdermin D decollete. De vrijgegeven N-terminale domein van gasdermin D wordt ingevoegd in het plasma-membraan, vorming van poriën waardoor plasmamembraan breuk en vrijlating van inflammatoire inhoud, naast een beschermende niche voor pathogen replicatie^5, weg te nemen ^{6 , 7}.

Hier focussen we op de goed bestudeerde NLRP3 inflammasome. De activering van de inflammasome van de NLRP3 vindt plaats via een proces in twee fasen⁸. De eerste stap van het “priming” vindt plaats via de erkenning door Toll-like receptors (TLR) van een microbiële product. Dit wordt gerepliceerd in het laboratorium-omgeving met behulp van LPS TLR4 stimuleren. Deze stimulatie upregulates NLRP3 en pro-IL-1β door signalering van NF-kB. Bovendien priming licenties NLRP3 via niet-transcriptionele mechanismen door inducerende haar deubiquitination^9,10 en fosforylering of defosforylerings van bepaalde residuen^11,12.

Het tweede signaal voor NLRP3 activering wordt gedacht aan het betrekken van mitochondriale factoren, reactieve zuurstof soorten, efflux van kalium en calcium signalering, hoewel een verenigende mechanisme voor NLRP3 activering ongrijpbaar^{8 blijft}. Geactiveerde NLRP3 oligomerizes door middel van interacties tussen de domeinen van de NACHT, en ASC werft via de binding van de pyrin (PYD) domeinen¹³. In elke cel vormen deze macromoleculaire complexen een enkele microscopisch zichtbaar focus. ASC werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een 22 KDa proteïne die vormt een “vlekje” tijdens de apoptosis van menselijke leukemie cellen en benoemde apoptosis-geassocieerde speck-achtige eiwitten met een kaart¹⁴. Later werd vastgesteld dat ASC pro-caspase-1 door de interactie van de kaart van ASC met de kaart van pro-caspase-1 werft, vormen de inflammasome¹⁵.

Niet alle NLRs vereisen de aanwezigheid van ASC ertoe caspase-1 activering. In tegenstelling tot NLRP3, NLRC4 en NLRP1b CARD domeinen hebt en pro-caspase-1 via CARD-CARD interacties voor het opwekken van caspase-1 activering rechtstreeks kunnen aanwerven. Bij gebrek aan ASC, actieve caspase-1 blijft diffuus in het cytosol en vormt niet een interne focus. Dit diffuse actieve caspase-1 is voldoende voor het opwekken van de dood van de cel van de pyroptotic, maar is niet pro-IL-1β^13,16te verwerken.

In dit manuscript, zullen we beoordelen inflammasome activeren op twee manieren. De eerste maakt gebruik van de fluorescerende activiteit probe, FAM-YVAD-FMK, die bindt de caspase-1 familie van proteasen. Deze familie omvat caspase-1, maar ook de muis caspase-11 en menselijke caspase-4 en caspase-5. Met behulp van macrofagen van caspase-1/11 deficiënte muizen in alle experimenten, zal de specificiteit van deze sonde worden aangepakt. Deze methode kan worden gecombineerd met het antilichaam labeling van componenten van de inflammasome, die we ook zullen beschrijven. Microscopische visualisatie maakt de identificatie van de individuele cellen met actieve caspase-1 en oligomerized ASC. Met behulp van deze methode, zal onderzoekers kunnen bepalen waar in de inflammasome formatie cascade hun manipulaties van de gastheercel of het ziekteverwekkende organisme onder studie een effect hebben. Men kan bijvoorbeeld, of een bepaalde interventie voorkomt u dat de aanwerving van ASC tot de complexe NLRP3 richt zich op de latere werving en activering van caspase-1¹⁷onderscheiden. Behandeling van de resultaten van caspase-1 activering zoals IL-1β afscheiding zou niet kunnen onderscheid maken tussen deze twee mogelijkheden. Ook kan de secretie van IL-1β worden gewijzigd zonder dat het vermogen van de cellen te activeren caspase-1 en pyroptotic cel dood¹⁶ondergaan.

De tweede methode meet de introductie van lactaat dehydrogenase (LDH) in de cel supernatant, die optreedt tijdens pyroptotic macrofaag lysis caspase-1 activering na zoals hierboven beschreven. Deze tweede methode is een populatie gebaseerde benadering het uitbrengen van LDH in het hele goed is gemeten. Deze eenvoudige aanpak zorgt voor de snelle analyse (30 min van incubatietijd) van monsters om te bepalen als er caspase-1-gemedieerde celdood en kan worden uitgevoerd in een 96-wells-plaat-indeling.

Deze methoden zijn complementair, elk met verschillende voordelen, en beide zijn gemakkelijk vatbaar voor wijzigingen. Macrophage behandeling met gerichte kleine molecuulgewicht verbindingen vóór inflammasome stimulatie kan bijvoorbeeld worden gebruikt te onderzoeken van de rol van bepaalde eiwitten kunnen hebben over de beheersing van de inflammatoire reacties.