De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

Todos los procedimientos animales realizaron adhiriéndose a nuestras directrices institucionales y aprobado por OPBA y el Ministerio de salud 1. generación de mamaria inducida por YAP vástago-como las células (yMaSCs) Nota: Todas las composiciones solución y los medios de comunicación para la sección 1 se especifican en la tabla 1. Aislamiento de poblaciones de la célula mamaria primaria Preparar bajo una campana de cultivo celular: bisturíes desechables, solución de hialuronidasa, medio de disociación, solución hemolítica, solución clasificación, colágeno capa solución, Ca2 + quelante solución de medio de lavado #1, lavar media #2, dispase solución, mamaria 2D medio de cultivo, hielo frío HBSS/PS. Para un experimento típico, sacrificar 10 ratones hembra (CD-1 de cepa C57BL/6), 8-12 semanas por dislocación cervical. Esterilizar el abdomen con abundante solución de etanol 70% antes de la disección. Diseccionar las glándulas mamarias haciendo una incisión en forma de Y a lo largo de la piel abdominal y separar cuidadosamente las glándulas del peritoneo tirando suavemente con unas pinzas Dumont. Colocar las glándulas disecadas en una células no adhesivo con hielo 10 mL frío HBSS/PS (20 glándulas para cada plato), asegurándose de no llevar sobre cualquier fragmento de piel. Bajo una campana de cultivo de tejidos, lavar una vez cada glándula en 10 mL de HBSS fresco/PS y colocarlos en un plato adhesivo de células no vacío (20 glándulas para cada plato). No utilice placas de cultivo de tejidos, ya que las células tienden a pegarse a ellos causando significativa pérdida de material. Pique finamente las glándulas mamarias con bisturí hasta obtener una mezcla homogénea de3 fragmentos de 1 mm. Recuperar el tejido picadito de cada plato en 10 mL de medio de disociación con una pipeta serológica de 25 mL para evitar la obstrucción y transferir la suspensión en un tubo cónico de 50 mL pipetear por lo menos 5 x para separar grupos de tejido.Nota: Para una digestión eficiente, picado adecuado del tejido en el paso 1.1.5 es crucial. Incubar durante 1 h a 37 ° C con agitación vigorosa continua. Después de 1 h, revise el homogeneizado y prolongar la incubación por 10 min si matas todavía están presentes. Girar el tejido digerido a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de tejido en 3 mL de solución hemolítica e incubar 3 minutos en hielo.Nota: La hemólisis es un tratamiento bastante áspero, tan estricta sincronización es crucial en este paso. Lavar las células con 10 mL de medio de lavado #1, girar el tejido digerido a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de tejido en 10 mL de medio de lavado # 2 y placa en platos de cultivo de tejidos de 10 cm. Incubar los platos por 1 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular.Nota: Este paso permitirá el retiro de la mayoría de los fibroblastos, que debe adherirse a la placa de cultivo. La suspensión de células se recuperan de los platos y vierta en un tubo cónico de 50 mL. Gira a 400 x g durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet dos veces en 10 mL de la Ca2 + quelantes solución por girar hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos cada vez. Resuspender el precipitado en 5 mL de 0.25% tripsina/EDTA e incubar 5 min a 37 ° C. Añadir 5 mL de solución dispase en la parte superior de la solución de tripsina y complementar con DNasa y 1μg/mL. Pipeta y bajar al menos 5 x a través de una 1 mL-punta desagregación de los grupos de ADN e incubar 10 min a 37 ° C, agitando cada 3 minutos. Añadir 10 mL de medio de lavado #2 y filtro en un tubo cónico de 50 mL nuevo a través de un tamiz de célula 40 μm. Girar por la suspensión de células a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante, asegurándose de eliminar todo el líquido. Purificación de células epiteliales mamarias por FACS Preparar la mezcla de anticuerpos mediante la adición de 10 μL Lin (anticuerpo del ratón de linaje cóctel), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), a una concentración final de 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, a una concentración final de 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, a una concentración final de 10 ng/mL , 2.5 μL anti-CD29, a una concentración final de 2,5 ng/mL.Nota: desde este 1.3 paso a paso, siempre funcionan en la oscuridad, para evitar el blanqueo de los anticuerpos de fluorescencia marcados. Para cada pelotilla: Mantenga una pequeña cantidad de células (sumergiendo una propina de 100 μL en el sedimento) en un tubo separado. Resuspender las células en 500 μL de la solución en un tubo de FACS de clasificación y mantener en hielo la muestra sin etiqueta para el procedimiento de FACS. Resuspender cada pellet en 200 μL de medio de lavado #1 Añada 44,5 μL de mezcla de anticuerpos, Pipetear cuidadosamente e incubar por 30 min en hielo en la oscuridad. Diluir la suspensión de células en 10 mL de medio de lavado #1, girar hacia abajo a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 2 mL de solución de clasificación y filtro a través de un tamiz del casquillo FACS tubeand proceder a FACS-separación de las poblaciones celulares (como en la figura 1B). Antes de realizar el protocolo de FACS multicolor, asegúrese de corregir el posible derrame de cada fluorocromo en cada uno de los otros. Para ello, incubar cada anticuerpo conjugado con fluoróforo por separado con la suspensión de la célula y medir valores de solapamiento espectral para fluoróforos todos y en todos los detectores, mediante controles del solo-color, con el fin de crear una matriz de compensación.Nota: En este experimento se empleó clasificador equipada con 85 μm boquilla. Una preparación típica de los 10 ratones hembra producirá aproximadamente 800.000 células de LD. Proceder a la filtración secundaria si matas forman durante procedimiento de FACS. Siembra de células mamarias primarias de LD Durante el procedimiento de FACS cubra una placa de cultivo de tejidos bien multi con colágeno que capa solución. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2 en una incubadora de cultivo celular. Retirar la solución de recubrimiento y lavado con lavado medio #1 justo antes de la galjanoplastia. Lavar las células recuperadas de procedimiento FACS con 10 mL de solución de lavado #1, girar por 400 x g durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en medio de cultivo 2D mamaria (500 μL/pocillo) y colágeno tratado placa. Que las células se sientan en una incubadora de cultivo celular para 48 h permitir el accesorio de celular apropiado y difusión.Nota: Para una clasificación típica de los ratones hembra 10, 6-8 pocillos de una placa de 24 pocillos múltiples bien producirá una densidad óptima de la célula (de 100 000 células/pocillo). Inducción de yMaSCs (células mamarias YAP-inducida del tallo)Nota: De este paso adelante, todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones BSL-2. Preparar el medio de Colonia mamaria. Recién agregar la matriz de la membrana del sótano al medio justo antes de la siembra de células. Para la inducción de YAP-inducida de células mamarias de la madre (yMaSCs), transducir las células primarias de LD por infección lentivirales mezclando un volumen de sobrenadante viral FUdeltaGW-rtTA, un volumen de sobrenadante FUW-tetO-ladrido (o TAZ), con dos volúmenes de suero mamaria Concentraciones de 2 x 2D medio de cultivo de suplementos, en un volumen total de 500 mL. Incubar las células con sobrenadantes lentivirales para 48 h. Para una típica preparación lentivirales, consulte el protocolo en línea22. Después de la infección, lave las células adherentes y tratar con mamaria 2D medio de cultivo suplementado con 2 doxiciclina μg/mL para inducir la expresión de genes exógena YAP (o TAZ). Utilizar células infectadas con vacío, vectores expresan EGFP o YAPS94A o células infectadas con vectores YAP (o TAZ) inducibles, aunque dejaron sin doxiciclina como controles negativos.Nota: Infección exitosa puede ser validada por qRT-PCR con cebadores específicos para transgenes humanos YAP , como se describió anteriormente1. Después de 7 días de inducción con doxiciclina, separar las células adherentes por la incubación con 0.05% tripsina/EDTA (150 μL/pocillo) por 10 min a 37 ° C; parar la tripsinización diluyendo 1:5 en medio de lavado #2 (600 μL/pocillo) y contar las células. Resuspender las células en el medio de Colonia mamario (1 mL en cada pocillo), suplidas con 2 μg/mL doxiciclina y la semilla a una densidad de clonogenic de 1.000 células/pozo en placas de 24 pocillos ultralow accesorio.Nota: Asegúrese de que el medio de Colonia mamaria es fria en el momento de la adición de matriz de la membrana del sótano. La matriz de la membrana del sótano debe siempre ser almacenada a-20 ° C a la llegada y descongelarse lentamente a 4 ° C durante la noche; una vez descongelado, se debe siempre ser manejado en el hielo, según las instrucciones del fabricante. Una vez YAP-expresar las células LD empezar proliferan y crecen como colonias MaSC-similares en suspensión (las colonias de yMaSC) (14 días después de la siembra), contar y proceso para más análisis (figura 1).Nota: Las células del control negativo (como en el punto 1.4.3) permanecerá como células individuales. Reponer el cultivo con medio fresco de Colonia mamaria cada 72 h durante los 14 días de crecimiento de la colonia de yMaSC. para ello prepare una alícuota de medio Colonia mamaria sin matriz de la membrana del sótano 5%, complementado con concentración de 10 x de suplementos y agregue 1:10 del volumen total de cada bien (por ejemplo 100 μL en 1 mL de medio total), para evitar la excesiva dilución de la suspensión de la matriz. El cultivo de yMaSCs Recuperar las principales colonias del medio Colonia mamaria, entonces se disocian y contaminar.Nota: yMaSC las colonias derivadas de células reprogramadas YAP LD adquieran capacidad de auto renovación y pueden ser con éxito el cultivadas sin más administración de doxiciclina (es decir, independientemente de la expresión de transgénico YAP/TAZ). Preparar, bajo una campana de cultivo celular, medio de Colonia mamaria como en el paso 1.4.1 y medio organoide mamaria. Recoger cada muestra e incubar en el volumen de exceso (10:1) de hielo frío HBSS por 1 h en el hielo, con el fin de solubilizar la matriz de la membrana del sótano. Lavar las colonias 3 x por centrifugación a 180 x g por 5 min y resuspender en hielo frío HBSS. Incubar las colonias en 0.05% tripsina/EDTA por 10 min a 37 ° C para obtener una suspensión unicelular. Colonias de la pipeta hacia arriba y abajo de 10 x con una punta de p1000 para asegurar la completa disociación a nivel unicelular. Células cuenta y resembrar en medio Colonia mamario (1 mL en cada pocillo) sin doxiciclina a una densidad de clonogenic de 1.000 células/pozo en placas de 24 pocillos ultralow accesorio. Repetir este proceso pases procedimiento cada 10-14 días para evaluar la auto renovación. Antes del tercer pasaje, pasaje yMaSC colonias en condiciones de cultivo de organoide, para potenciar la expansión yMaSC y para permitir la formación de las glándulas del mini, que auto-organizarse en un epitelio amfifílicas recuerdo cerca de la glándula mamaria de en vivo organización histológica. Recuperar colonias del medio como en el paso 1.5.3 a 1.5.4 Colonia mamaria. Resuspender colonias en factor de crecimiento de 100% reducen la matriz de la membrana del sótano, teniendo en cuenta que replate un máximo de 20-25 colonias para cada pocillo de una placa de 24 pocillos ultralow accesorio en 150 μL de la matriz. Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular por 40 min a 37 ° C y la matriz de la membrana del sótano solidificar y luego sobreponer los geles con 500 μL de medio de organoide mamaria. Después de unos días busque la formación de colonias para formar budding organoides (Figura 1E). Después de 10-14 días, el paso o proceso organitas para su posterior análisis. Culturas de organoides de paso, recuperar organitas recogiendo cada muestra y incubando en exceso volumen (10:1) de hielo frío HBSS por 1 h en el hielo, con el fin de solubilizar la matriz de la membrana del sótano. Lavar organitas 3 x por vuelta abajo a 180 x g durante 5 min y resuspender en hielo frío HBSS. Incubar organitas en 0.05% tripsina/EDTA por 10 min a 37 ° C para obtener una suspensión unicelular. Pipeta organitas arriba y abajo de 10 x con una punta de p1000 para asegurar la completa disociación a nivel unicelular. Contaminar una suspensión unicelular en una caída de factor de crecimiento de 100% membrana basal reducida matriz (150 μL de cada pocillo de una placa de 24 pocillos ultralow accesorio). Que la matriz de la membrana basal forman un gel por 40 min a 37 ° C en un incubador de la cultura de célula de incubación y sobreponer los geles con 500 μL de medio de organoide mamaria.Nota: yMaSC organoides pueden ser cryopreserved mediante la recuperación de la cultura de matriz de la membrana del sótano 100% como en el paso 1.5.13, evitando la tripsinización. Almacenar en el organoide mamaria suplementado con 10% de DMSO. Congelar rápidamente el organitas yMaSC a-80 ° C y luego conservado en nitrógeno líquido. 2. generación de yDucts Nota: Todas las composiciones solución y los medios de comunicación para la sección 2 se especifican en la tabla 2. Aislamiento de acinos pancreáticos primarios Coloque pinzas de disección y tijeras en el 70% EtOH y preparar bajo un campana acinar cultivo medio de cultivo celular, 15 mL para cada ratón; medio de recuperación acinar, 60 mL de cada ratón; PBS/PS; colagenasa de la solución madre. colagenasa solución A, 15 mL para cada ratón; neutralizado de cola de rata colágeno solución. Neutralizar el colágeno de cola de rata que a pH = 7, ajustando primero con 0,1 N NaOH para amortiguar el ácido acético en que el colágeno se disuelve y luego con 10N HCl. diluir 2,5 mg/ml en PBS/PS. mantener el colágeno de la cola de rata I y todos los reactivos en el hielo para neutralizarlo. Sacrificio de 6 a 9 semanas de edad ratones de genotipo apropiado. Coloque cada ratón en su parte posterior y lavar el abdomen con solución de etanol 70%. Haga una incisión longitudinal a lo largo de la pared abdominal. Localizar y disecar el páncreas (mediante el bazo como una guía) y colocar en un plato adhesivo de 10 cm no celular en hielo 10 mL PBS/PS. transferencia de frío los platos inmediatamente bajo una campana de cultivo celular. De este paso trabajar siempre bajo una campana de cultivo celular. Transferir cada páncreas en una nueva célula no plato adhesivo previamente llena con 7 mL de colagenasa solución A. Rápidamente le pique cada páncreas con un par de escalpelos desechables, para obtener una suspensión homogénea de tejido de unos fragmentos de3 mm 1.Nota: Es importante tener en cuenta que este procedimiento debe tomar no más de 2 minutos para viabilidad celular óptima. Incubar el plato para la digestión de la colagenasa a 37 ° C, 5% CO2 en una incubadora de cultivo celular durante 10 minutos, agitando cada 3 minutos para asegurar la digestión de tejido homogéneo. Recuperar el tejido digerido en un tubo cónico de 50 mL (uno para cada páncreas), lavar el plato con 10 mL de medio de lavado Acinar y colocar en el mismo tubo cónico de 50 mL, pipeteo digiere tejido arriba y abajo x no más de 3. Girar el tejido digerido por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante.Nota: Desactivación de las células a 18 ° C para reducir la actividad de la colagenasa durante este paso. Suspender el tejido pellets en 7 mL de colagenasa y solución A y vierta esta solución en un nuevo cm 10 células no adhesivo. Incubar el plato para una segunda ronda de la digestión de la colagenasa a 37 ° C durante 10 minutos como en el paso 2.1.5, sacudiendo cada 3 minutos para asegurar la digestión de tejido homogéneo. Mientras tanto, preparar un tubo cónico de 50 mL limpio para cada páncreas con un colador de celular 100 μm. Recuperar el tejido digerido y pasar por el colador de la célula de 100 μm por macerar el tejido con un émbolo de la jeringa de 10 mL estéril (Asegúrese de que presione con cuidado el tejido, evitando las fuerzas de corte tangencial a la superficie del filtro). Lavar el plato con 10 mL de medio de lavado acinar y pasar este 10 mL de la misma 100 μm células el filtro. Girar el tejido digerido por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante. Recuperar el pellet de tejido con 10 mL de medio de lavado acinar. Transferir la solución de células en un tubo cónico de 50 mL ya que contiene más 10 mL de medio fresco lavado acinar, evitando el uso excesivo por resuspensión de la pelotilla. Girar el tejido digerido por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante. Suspender el tejido digerido en 6 mL de medio de recuperación acinar y repartirlo en 2 pocillos de multi 6-bien bien cultura de tejido placa, 3 mL. Bajo un estereomicroscopio evaluar cuidadosamente la calidad del aislamiento acinar, que aparecen como una suspensión homogénea de grupos acinares, con una menor proporción de las células (ver figura 2B); quitar cualquier tejido grandes grupos eventualmente presentan (normalmente visible a simple vista), mediante pipeteo fuera de la solución. Siembra de acinos pancreáticos primarios Incubar los grupos acinares digeridos a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular para 2 h, para permitir la recuperación de la célula. En la capa de recuperación celular 48-bien multi pozos con 100 μL de colágeno cola neutralizado rata me e incubar durante 1 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular para permitir que un cojín de hidrogel para formar. Después de 2 h de recuperación de la célula, recoger suspensión acinar de la célula en un tubo cónico, desactivación por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante. Resuspender los acinos en el volumen adecuado de medio de cultivo acinar (150 μL de cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 48). Semilla cada páncreas disociado en 16 pozos para obtener una densidad óptima (100-120 grupos acinares/bien). Diluir la suspensión acinar con un volumen igual de colágeno de cola de rata neutralizado solución, manteniendo los tubos en hielo. Mezclar con cuidado y rápidamente la semilla la suspensión de células en la parte superior del cojín de colágeno descrito en 2.2.2 (300 μL de cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 48 multi bien). Incubar 1 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular para permitir un hidrogel para formar. Inducción de organoides pancreático Superposición de hidrogeles de colágeno con 500 μL de Acinar medio de cultivo suplementado con 2 doxiciclina μg/ml para la inducción de YAP-dependiente de organoides pancreática de R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A ratones; controles negativos son provistos por wt células cultivadas en las mismas condiciones o R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A células cultivadas en ausencia de doxiciclina. Células acinares de la cultura en Acinar medio de cultivo suplementado con 2 doxiciclina μg/mL durante 5 a 7 días refrescante medio de cultivo (300 μL/pocillo) cada 48 h y después formación de organoide por cambios morfológicos hacia quiste formando estructuras ductales como ( Figura 2). Una vez que se forman los organoides, células pueden pasadas en condiciones de cultivo pancreático organoide o cosechadas para mayores análisis (p. ej.: extracción de RNA, inmunofluorescencia). El cultivo de organoides pancreático Para evaluar su capacidad de auto renovación, clonally paso organitas pancreática inducida por YAP (yDucts) en hidrogeles de matriz tridimensional la membrana del sótano (condiciones de cultivo de organoide pancreático) independientemente de fuente exógena de YAP/TAZ (es decir. independientemente de la administración de doxiciclina). Preparar tripsina 0,05%/EDTA; matriz de membrana basal reducido factor de crecimiento de 100%; Pancreático organoide medio y colagenasa solución B. Preparar un 15 mL cónico tubo con 4 mL de colagenasa y solución B de cada pozo para ser pasados. Descartar el medio de cultivo, cuidadosamente extraer hidrogeles de los pozos por aspiración suave y transferirlas a tubos cónicos. Incubar los tubos a 37 ° C por 30 min, con continua agitación vigorosa para permitir la digestión completa de la matriz de colágeno (verificación cada 10 minutos hasta que el hidrogel es completamente solubilizado). Desactivación de las células recuperadas a 750 x g durante 2 min y retirar el sobrenadante. Incube las células recuperadas en 1 mL de tripsina 0,05%/EDTA durante 10 min a 37 ° C para obtener una suspensión unicelular. Diluir la tripsina con 9 mL de PBS 1 x, desactivación a 750 x g durante 2 min y retirar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en matriz de hielo frío del factor de crecimiento reducida membrana del sótano y semillas en placas de fijación ultra baja (generalmente una caída de 150 μL en un pocillo de una placa de 24 pocillos). Que la membrana del sótano matriz hidrogel solidificar por incubar las placas en una incubadora de cultivo celular 40 min a 37 ° C y luego recubierto con pancreático organoide medio (500 μL de cada pocillo). yDucts crecerá como quiste-como organoides en 7-10 días (Figura 2D). Para más pases organitas pueden eliminarse de la matriz de la membrana del sótano por la incubación en hielo frío PBS 1 x durante 30 minutos, seguido por lavado 3 veces vuelta abajo a 180 x g por 5 min y resuspensión en hielo frío PBS 1 x para evitar la contaminación de la matriz. Organoides son entonces disociados con tripsina 0,05% por 10 min obtener una suspensión de células individuales y resembrados en matriz de la membrana del sótano fresco y entonces overlaid con medio organoide pancreático (como 2.4.7-2.4.8). yDuct organoides pueden criopreservados en nitrógeno líquido mediante la recuperación de la cultura matriz de la membrana del sótano 100% como en el paso 2.4.9, evitando la tripsinización, y almacenar en pancreático organoide medio suplementado con 10% de DMSO. yDuct organoides son rápidamente congelados a-80 º c y luego conservados en nitrógeno líquido.