Identifikasjon av dopamin D1-alfa reseptoren i nucleus accumbens er avgjørende for å avklare D1 reseptor dysfunksjon under en sentralnervesystemet sykdom. Vi utførte en roman RNA i situ hybridisering analysen for å visualisere enkelt RNA molekyler i et bestemt hjernen.
I sentralnervesystemet er D1-alfa undertype reseptoren (Drd1α) den mest tallrike dopamin (DA) reseptoren, som spiller en viktig rolle i å regulere dannes hemmer nevronal vekst og utvikling. Mekanismene bak Drd1α reseptor unormalt formidling atferdsdata svar og modulerende arbeider minnefunksjon er imidlertid uklart. Bruker en roman RNA i situ hybridisering analysen, identifisert denne studien dopamin Drd1α reseptoren og tyrosin hydroksylase (TH) RNA uttrykk fra DA-relaterte kretsene i nucleus accumbens (NAc) området og substantia nigra-regionen (SNR), henholdsvis. Drd1α uttrykk i NAc viser en “diskret dot” flekker mønster. Klart Kjønnsforskjeller i Drd1α uttrykket ble observert. Derimot viser TH et “klynger” flekker mønster. Om TH uttrykk vises hunnrotter et høyere signal uttrykk per celle i forhold til mannlig dyr. Metodene presenteres her gi en roman i situ hybridisering teknikk for å undersøke endringer i dopamin systemet dysfunksjon under utviklingen av sentralnervesystemet sykdommer.
Dysfunksjon av dopamin striatal er involvert i utviklingen av kliniske symptomer i flere nevrokognitive sykdommer. Dopamin D1 reseptorer finnes i prefrontal cortex (PFK) og striatal områder av hjernen og påvirke tungt kognitive prosesser1, inkludert minne, timelige behandling og lokomotiv atferd2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. forrige studier belyst at endringer av dopamin D1 reseptorer var knyttet til utviklingen av oppmerksomhet underskudd hyperaktivitet disorder (ADHD)8nevrokognitive symptomene i schizofreni9, 10 og stress mottakelighet11. Spesielt i schizofreni indikerte fantes et positron utslipp tomografi (PET) studier at bindingen evne til dopamin D1 reseptorer i prefrontal halvdelene var svært knyttet til kognitiv underskudd og tilstedeværelsen av negative symptomer11. Dendrittiske veksten av eksitatoriske nerveceller i prefrontal cortex regulert av dopamin D1 reseptoren lindrer stress mottakelighet. Videre kan knockdown D1 reseptoren i mediale prefrontal kortikale (mPFC) neurons forbedre de sosiale nederlag stress-indusert sosiale unngåelse12.
Her introduserer vi en teknikken av RNA i situ hybridisering visualisere enkelt RNA molekyler i en celle med frisk-frosne vevsprøver. Nåværende teknikken har flere fordeler fremfor metoder som finnes i gjeldende litteratur. Først gjeldende prosedyre bevarer romlige og morfologiske sammenheng av vev og ble utført på frisk-frosne vevsprøver slik at andre prosedyrer krever friske, ikke-innebygd vev kan kombineres med gjeldende metoder. Lignende fremgangsmåter i formalin-fast og parafin-embedded vev har illustrert at enkelt transkripsjon oppløsning kan oppnås ved hjelp av en RNA i situ hybridisering teknikk13. Påvisning av RNA på enkelt transkripsjon nivå gir overlegen følsomhet til lav kopi talluttrykk samt muligheten til å sammenligne genuttrykk nivået av individuelle celler som kan oppnås ved andre nukleinsyre gjenkjenningsmetoder som polymerase kjedereaksjon (PCR) teknikker. I tillegg opprettholder det aktuelle metoden bilder med høy signal-til-støy forholdet gjennom svært spesifikke RNA sonder som hybridiserte til enkelt mål RNA transkripsjoner, og sekvensielt bundet med en kaskade av signal forsterkning molekyler i deteksjon system. Til slutt gir den nåværende teknologien mulighet til å vurdere flere biologiske systemer med sin mål-spesifikke proprietære sonder, i stedet for å begrense våre undersøkelser bare én klasse av systemrelaterte markører som proteinet oppdagelsen av immunohistochemistry metoder.
I vår studie brukte vi denne romanen RNA i situ hybridisering for å evaluere Drd1α reseptor uttrykk i nucleus accumbens (NAc) og tyrosin hydroksylase (TH) uttrykk i substantia nigra (SNR) av både mannlige og kvinnelige F344/N rotter. Nyskapende RNA i situ hybridization aktivert vi mekanismer påvirke både DA opptak og DA utgivelsen samtidig, forbedre vår forståelse av striatal DA systemets kompleksiteten. Her beskriver vi prosedyren for frisk-frosne hjernen skiver og gir metoder for analyse for ulike flekker mønstre: “diskret dot” eller “klynger”.
I denne protokollen beskriver vi romanen teknikk i situ hybridisering for frisk-frosne hjernen skiver å evaluere Drd1α reseptor uttrykk i nucleus accumbens (NAc) og tyrosin hydroksylase (TH) uttrykk i regionen substantia nigra (SNR). Vi tilbyr også metoder for analyse for ulike flekker mønstre: “diskret dot” eller “klynger”.
Kritisk trinnene for en vellykket multiplex fluorescens RNA i situ hybridisering analysen er inkludert. Når decapitating rotta og fjerne hjernen, Fr…
The authors have nothing to disclose.
Nåværende verkene ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd HD043680, MH106392, DA013137 og NS100624. Delvis fondet ble levert av NIH T32 trening stipend i biomedisinsk-atferdsterapi vitenskap.
HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |