Mouse e humanos derivada de cultura de monocamada epitelial gástrica primária para o estudo da regeneração
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para o estabelecimento e cultivo humano e rato derivada de 3-dimensional organoids gástrica (3D) e o método de transferência de organoids 3D para um monolayer 2-dimensional. O uso da monocamada epitelial gástrica como um romance ensaio de zero-ferida para estudos de regeneração também é descrito.
Abstract
Estudos in vitro de reparação da ferida gástrico normalmente envolve o uso de linhas de células de câncer gástrico em um ensaio de zero-ferida de migração e proliferação celular. Uma limitação crítica desses ensaios, no entanto, é sua variedade homogênea de tipos celulares. Reparo é um processo complexo, que exige a interação de vários tipos de células. Portanto estudar uma cultura desprovida de subtipos celulares, é uma preocupação que deve ser superada, se quisermos entender o processo de reparação. O modelo de organoides gástrica pode aliviar esse problema pelo qual a coleção heterogênea de tipos de células intimamente reflete de epitélio gástrico ou outros tecidos nativos em vivo. Demonstrado aqui é um romance, em vitro ensaio zero-ferida derivada de humanos ou rato organoids 3-dimensional que pode então ser transferidos para uma monocamada epitelial gástrica como qualquer organoids intacta ou como uma suspensão de célula única de dissociado organoids. O objetivo do protocolo é estabelecer monocamadas de epiteliais gástricas organoides-derivados que podem ser usadas em um sistema de romance ensaio de zero-ferida para estudar regeneração gástrica.
Introduction
O uso de ensaios de zero-ferida é um método popular para o estudo de reparo e regeneração1,2,3,4,5,6. A metodologia proposta pode ser usada para estudar especificamente a regeneração gástrica e a colonização de Helicobacter pylori . No passado, linhas de células de câncer gástrico têm sido usadas como um meio para estudar de1,de infecção de Helicobacter pylori (H. pylori)2 e até câncer gástrico recentemente linhas de células como as células AGS foram favorecidos1 ,2,3,4. Uma limitação das culturas de células de câncer gástrico é sua incapacidade de recapitular a diversidade celular do epitélio gástrico. Para tentar resolver essa limitação, demonstrado que aqui é a criação e transferência de primários humanos e rato derivada de 3-dimensional gástrica gástrica organoids (FGOs) para uma monocamada epitelial gástrica para ensaios de cura ferida com base em um método modificado primeiro descrita por Schlaermann et al. 7 Nós demonstramos que gástrico monocamadas epiteliais derivadas cisalhadas 3D FGOs gástricas ou FGO-derivado de células únicas retêm uma composição celular polarizada que representa perto de epitélio gástrico in vivo. Dado que linhas de células de câncer gástrico não demonstrar a composição da célula que exibe esta técnica, o protocolo atual tem uma vantagem sobre os métodos de ensaio alternativos de zero-ferida. Esta metodologia foi otimizada pelo qual monocamadas podem ser estabelecida de toda organoids ou de uma suspensão de célula única de organoids dissociada e chapeado usando uma matriz de membrana basal ou revestimento de colágeno. O objetivo geral do presente protocolo é estabelecer que um organoides derivado de culturas de monocamada epitelial gástrica para um ensaio de cura ferida novela.
Protocol
Representative Results
Discussion
O atual protocolo detalha a criação de monocamadas de epitelial gástrica humanos e rato-derivados que podem ser usados para ensaios de zero-ferida. O protocolo depende do conceito de células-tronco residentes tecidos de isolamento de humanos primários (ou mouse) e é um protocolo modificado publicado pela primeira vez por Schlaermann et al.7. Em particular, temos otimizado o protocolo aqui para estabelecer uma confluente e polarizada gástrica monocamada epitelial que expressa o majo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 conceder (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
Referencias
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
