人干扰素α超灵敏单分子阵列数字酶联免疫吸附试验的研制与验证

1. 抗体的选择 在开始之前, 该协议审查所有关键步骤 (表 1) 和选择最佳抗体。注意: 对于这个协议高亲和力抗干扰素α抗体-IC50 在表 2中所描述的选择。优先选择对传统 ELISA 有效的配对。 2. 对顺磁珠捕获抗体的共轭和不同浓度的测试 注: 在抗体共轭过程中, 始终保持珠共轭缓冲 (BCB) 和珠洗涤缓冲 (BWB) 在冰上。 捕获抗体缓冲交换 以初始数量的抗干扰素α抗体 A 测试3不同的珠动词比 (0.038 毫克/毫升, 0.075 毫克/毫升, 0.3 毫克/毫升)。注: 低抗体涂层浓度可以是有益的, 如果检测提出了高背景信号。在缓冲交换过程中, 初始抗体数量应占估计损失的30%。根据制造商的指示和为了减少最初的背景, 测试了0.05 毫克/毫升, 0.1 毫克/毫升和0.3 毫克/毫升的浓度, 虽然这些确切的值往往没有得到由于上述可变损失的缓冲交换过程。 将所需的抗体量添加到过滤器列连同 BCB, 最多可达500µL。 离心机在 > 1万 x g 的列5分钟, 并丢弃流经。 通过在 > 1万 x g 处添加450µL 的总容积, 然后将其 BCB 为5分钟, 并将其丢弃, 然后将该列清洗两次。 将含有抗体的过滤器列放置在一个干净的离心管中倒置–该柱面的开口部分朝向新管的内侧, 离心机在 800 x g 处为1分钟。注意: 此步骤将允许收集已清除的抗体。此步骤不需要缓冲区添加。 用50µL BCB 和离心机在 800 x g 处冲洗膜, 2.1.5 1 分钟。 用低容积分光光度计测定抗体浓度。 添加 BCB 以达到所需的抗体浓度并记下最终音量。注: 200 µL 的体积将用于描述协议的其余部分, 这个卷被称为2卷 (2V)。所有以下试剂卷将相应地被适应。 漩涡, 并保持冰。 顺磁珠制备 将 2.8 x 108珠子 (100 µL = 1V) 转移到离心管中。注: 珠子的体积取决于2.1.8 获得的最终体积。 脉冲旋转, 放入磁选机1分钟, 丢弃稀释剂, 从磁铁中取出。 加入2V 的 BWB 和涡旋5秒。 重复2.2.2 和2.2.3 两次, BWB 和两次 BCB。 对于1V 的珠子添加190µL BCB, 涡 5 s, 脉冲旋转, 并储存在冰上洗净珠。 珠活化 将1毫升的冷 BCB 加入10毫克的 1-乙基 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 盐酸盐 (EDC) 和涡流, 直到溶液是均匀的。 对于1V 的珠子添加10µL 冷稀释的 EDC 到洗涤珠, 漩涡, 并保持在一个振动筛在 1000 rpm 30 分钟的室温。注: 由于在水溶液中的不稳定性, 应尽快完成对小珠的制备和添加。同时, 由于该系统具有极强的反应性, 所以在添加前必须有一个均匀的珠悬浮, 以防止异质珠的活化。添加后, 珠子必须保持悬浮。 抗体的珠共轭 涡旋和脉冲旋转活化珠。现在把珠子放在磁选机里1分钟, 扔掉 BCB 上清, 然后把管子从磁铁上取下。 用2V 的 BCB 把珠子洗净。涡流, 脉冲旋转, 并把磁选机1分钟。然后丢弃 BCB 缓冲器, 从磁铁中取出珠子。 快速添加冷, 缓冲交换200µL (2V) 抗体的活化珠。 涡流, 并保持在室温下的振动筛2小时。 珠封和最终清理 脉冲旋转的抗体涂层珠悬浮, 放在磁分离器1分钟, 转移到新的管, 并测量浓度与低容积分光光度计。注意: 这一步将提供有关珠子是否饱和的信息–任何高于零的值都会显示珠饱和度–因为检测到无法绑定到珠子的可溶性抗体将是可测量的。 从磁铁中取出共轭珠, 加入2V 的 BWB, 涡流为5秒, 脉冲旋转, 并放入磁选机中1分钟。 用低容积分光光度计将上清液转移到新管中, 测量浓度。注意: 此步骤将提供有关抗体是否稳定地固定在珠子上的信息。在这上清液中检测到的抗体浓度将表明从珠子中分离出的抗体, 这种现象经常发生。即使很少的捕获抗体仍然附着在珠子上, 这种化验也常常奏效。 从磁铁中取出共轭珠, 加入2V 的 BWB, 涡流为5秒, 脉冲旋转, 并放入磁选机中1分钟。 从磁铁中取下共轭珠, 在室温下加入2V 的珠挡缓冲器, 涡旋5秒, 在振动筛中孵化30分钟。 用 2V, 一次与 BWS, 和2x 与珠稀释剂缓冲 (丢弃所有上清液) 清洗抗体涂层和被阻拦的珠子3x。 将涂层和被堵塞的珠子贮存在4°c 中, 直到使用2V 的珠稀释剂缓冲。注: 在使用前, 必须使用磁选机用 250 x 珠 volume/20, 用探测器/样品稀释剂清洗一次珠子。 3. 检测抗体 Biotinylation 检测抗体缓冲交换 服用260µg 的两个抗干扰素抗体克隆。注意: 这在缓冲交换过程中考虑到30% 的损失, 并允许测试两种不同的生物素/抗体比值。 使用 Biotinylation 反应缓冲器 (BRB) 代替 BCB 进行2.1。 测量体积和抗体浓度, 调整体积以获得最终浓度为1毫克/毫升。注: 这是一个建议的开始浓度, 但它可以优化, 如果化验没有达到所需的灵敏度。 检测抗体 Biotinylation 把 N-hydroxysuccinimide-polyethylene-glycol4-biotin (NHS-PEG4-Biotin) 到室温和并用重悬共400µL 蒸馏水, 达到3.4 毫米的浓度。 确定生物素: 抗体比测试和混合检测抗体和稀释的生物素相应地 (60:1 比率等于100µL 检测抗体和4.5 µL 生物素)。注: 开始, 测试30:1 和60:1 比率。 在室温下, 将抗体-生物素混合, 脉冲旋转和孵育30分钟。注: 不需要摇动。 生物素化检测抗体纯化 将生物素化抗体转移到新的过滤器中, 并进行 2.1, 执行3洗涤步骤与 BRB (400, 450 和450µL) 和最终收集。 测量纯化, 生物素化检测抗体的体积和浓度, 贮存在4摄氏度, 直到使用。 4. 检测优化 注: 使用单分子阵列分析仪软件的自制配置30。单分子阵列分析仪由软件控制, 允许运行化验标准化, 执行样品 quantifications, 修改外部参数 (珠, 探测器, SBG, RGP 浓度; 样品稀释…) 和内部参数 (步骤数, 孵化时间…), 以达到最佳的化验条件, 也可以用来计算结果 (背景, LOD, 数量)。对于单分子阵列分析仪的设置和计算每轮优化所需的试剂量, 请参阅制造商的说明。使用2步配置执行第一轮优化。 在两种构型中检测捕获抗体-共轭珠和生物素化检测抗体的组合。 测试组合三不同的抗干扰素α A 捕获抗体浓度与两种不同的抗干扰素α B biotinylation 比作为检测和捕获抗体, 反之亦然 (图 1) 通过选择适当的条件在分析器软件。 选择最敏感的组合, 即提供最低 LOD 的条件, 并使用它进行进一步的步骤注:图 1显示了0.3 毫克/毫升抗干扰素α a 抗体珠浓度和生物素: 抗体比值30:1 与抗干扰素α B 抗体导致最高灵敏度, 这证明了 LOD 11.6 的成品/毫升。(见补充表 1)。此组合将用于所有未来步骤。注意, 在任何一轮优化之前, 这一特定的检测都达到了极大的灵敏度。 图 1: 选择抗体定位, 捕获抗体浓度的珠子和 biotinylation 比.用抗干扰素α A 作为捕获抗体和抗干扰素α B 作为检测抗体 (a), 对两种可能的不同构型进行了测试, 反之亦然 (B)。IFNα-2c 被用作抗原。不同的捕获抗体浓度和生物素: 抗体 (B: A) 比率也测试两种配置。虚线显示 LOD 的最佳状态;抗干扰素α A 0.3 毫克/毫升作为捕获和抗干扰素α B 生物素: 探测器抗体比为 30 (LOD = 11.6 毫克/毫升对应的 AEB 值 0.017265)。使用了2步配置。生物素: 抗体 (B: A).请点击这里查看这个数字的大版本. 比较2与3步配置。注: 在3步的配置中, 有三种不同的孵化步骤, 一个与捕获抗体, 一个与检测抗体和最后第三个 SBG 酶标记。然而, 在2步的配置中, 捕获和检测抗体同时与感兴趣的分析物一起孵化。 运行单分子阵列分析仪与捕获和检测抗体浓度和比率从4.1.2 选择2和3步配置预先配置在分析仪, 按照制造商的指令30。 选择允许最高灵敏度的配置, 并将其保留为将来的步骤注: 如图 2和辅助表 2所示, 2 步配置给每个浓度测试提供了稍微高的灵敏度和信号/背景比。因此, 为将来的步骤保留了2步的配置。 图 2: 2 vs 3 步配置比较.使用0.3 毫克/毫升抗干扰素α抗体作为捕获和抗干扰素α B 作为检测抗体的30生物素: 抗体比, 对2和3步构型进行了评估。IFNα-2c 被用作抗原。在3步条件设置中, 有三种不同的孵化步骤, 一个与捕获抗体, 一个与检测抗体和最后第三个 SBG 酶标签。然而, 在2步的配置中, 捕获和检测抗体同时与感兴趣的分析物一起孵化。请单击此处查看此图的较大版本. 检测抗体与 SBG 浓度优化 测试三不同浓度的检测抗体 (0.1, 0.3, 0.6 µg/毫升) 连同三不同浓度的 SBG (50, 150, 和 250 pM) 如上文所述30。 选择具有最高灵敏度的浓度, 并保持它们的未来步骤。注:图 3显示探测器0.3 µg/mL 和 SBG 150 pM 是显示最佳 LOD 的条件。这些条件也给出了低背景水平和中等振幅, 这种行为产生良好的标准偏差 (SD) 值 (辅助表 3)。典型的浓度范围在 0.1-1 µg/毫升之间的检测抗体和 50-200 pm 为 SBG, 虽然更高浓度 (如多达 300 pM) 的后者可能需要。重要的是要避免的条件, 将使背景高于 0.02 AEB。增加检测单克隆抗体 (SBG) 的浓度将提高信号响应和背景。然而, 如果信号的增量超越背景的变化, LOD 将会改善。可能出现的情况是, 背景的减少使低校准仪之间的差别更高。 图 3: 探测器和 SBG 浓度优化.评估了三种不同浓度的生物素化检测抗体 (0.1、0.3 和0.6 µg/毫升) 和三种不同浓度的 SBG (50、150和 250 pM)。虚线显示 LOD 的最佳状态;检测抗体在0.3 毫克/毫升和 SBG 150pM (LOD = 0.09 毫克/毫升对应的 AEB 值 0.017184)。请单击此处查看此图的较大版本. 其他优化步骤 如果未达到所需的灵敏度, 请使用分析器软件中的预配置选项测试不同步骤的不同潜伏期。 如果检测不够灵敏, 请使用分析器软件中预配置的选项优化每种检测的珠子数量。注: 一旦生物样品的测试开始, 样品体积是一个附加参数易受优化。确保样品根据健康和安全程序进行处理。 5. 化验特异性和重现性 测试干扰素-α测定特异性, 通过测试与不同的干扰素α亚型和其他相关的蛋白质 (图 4a和4b)。 图 4: 优化 IFNα单分子阵列法的特异性和灵敏度.(a) 对干扰素β、IFN-λ1、IFN-λ2、干扰素和干扰素-γ重组蛋白进行了测试, 以及 (B) 16 亚型干扰素α, 包括三种 IFN-α2类型 (IFN-α2a、IFN-α2b 和 IFN-α2c)。改编自 Rodero等。2017.请点击这里查看这个数字的更大版本. 通过执行三项独立的复制实验和评估相互间的变异 (图 5), 评估优化试验的重现性。 计算检测的 LOD注: LOD 是用三空白 + 3 标准差 (SD) 的平均值计算的, 从而获得0.23 的 fg/mL 值。由于标准样品稀释系数为 1:3, 稀释因子的加入给出了0.69 个成品/mL 的 LOD。 图 5: 优化的 pan-干扰素-α单分子阵列测定的重现性.三独立运行使用两种不同的珠子进行。对第二批进行了两次独立实验。每项测量都以重复的方法获得。虚线代表的 LOD, 由平均空白平均酶每珠 + SD 的所有运行。IFN-α17被用作参考, 考虑到衍生标准曲线是所有其他干扰素α亚型的代表, 如图 4b所示。图中显示平均值和 SD (误差线)。虚线显示不同运行的 LOD;运行 1: 0.073 个成品/毫升 AEB = 0.006238, 运行 2: 0.113 fg/毫升 AEB = 0.007119, 运行 3: 0.043 成品/毫升 AEB = 0.05518)。改编自 Rodero等。2017.请点击这里查看这个数字的更大版本. 6. 蛋白质竞争化验 进行蛋白质竞争分析 (如图6所示), 进一步证明化验的特异性。注: 使用 SLE 患者血浆样本 (n = 5)。 当怀疑在生物样品中存在病毒时, 通过将非 ioinic 表面活性剂 (0.5% nonidet P40 替代物) 的200µL 添加到40毫升探测器/样品稀释剂中, 并大力进行涡流制备钝化缓冲器。 离心生物样品含有1万克的感兴趣的分析物, 15 分钟4摄氏度, 以去除细胞碎片。 混合185µL 检测器/样品稀释剂或灭活缓冲器与100µL 生物样品 (最终稀释因子 3) 和15µL 抗干扰素α抗体 A (初始浓度1毫克/毫升, 最终浓度50微克/毫升) 或缓冲。室温下孵育30分钟。 如上文所述, 在单分子阵列分析仪上运行无抗干扰素α抗体的样品。注: 在信号饱和情况下, 样品应进一步稀释。另外, 300 µL 是重复分析所需的卷。 图 6: 蛋白质竞争化验.采用五种不同 SLE 患者的样本进行了竞争实验。生物样品在4摄氏度离心10.000 克, 15 分钟。他们被稀释1/3 与检测器/样品稀释剂含有 NP40 病毒灭活。15µl 抗干扰素α抗体 A (初始浓度1毫克/毫升, 最终浓度50µg/毫升) 或缓冲增加到总体积300µL. 在室温下进行孵化30分钟. 对照组以灰色和抗干扰素α A 治疗样品为例。抗体以黑色显示。图显示平均值和 SD (误差条)。虚线代表 LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/毫升)。从 Rodero等2017 适应, 请点击这里查看这个数字的大版本.