Diese Studie untersucht die neuartige Verwendung von Enzymbasis Mikroelektrode Array (MEA) Technologie zur Überwachung der in Vivo Aktivität der Neurotransmitter bei Ferkeln. Die Hypothese war, dass Glutamat Dysregulation der Mechanismus der Narkose Neurotoxizität beiträgt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur MEA-Technologie, um den Mechanismus des Anästhesie-induzierte Neurotoxizität studieren anzupassen.
Jedes Jahr werden Millionen von Kindern Narkose für eine Vielzahl von Verfahren unterzogen. Jedoch haben Studien an Tieren und Menschen die Sicherheit der Narkose bei Kindern, Verwicklung Anästhetika als potenziell giftig für das Gehirn in der Entwicklung in Frage gestellt. Bislang keine Studien haben erfolgreich die Mechanismen aufgeklärt durch die Narkose neurotoxischen sein kann. Tierexperimentellen Studien erlauben Untersuchung solcher Mechanismen und Neugeborenen Ferkel stellen ein hervorragendes Modell, diese Effekte aufgrund ihrer entwicklungspolitischen auffallenden Ähnlichkeiten zum menschlichen Gehirn zu studieren.
Dieses Protokoll passt sich den Einsatz von Enzym-basierte Mikroelektrode (MEA)-Array-Technologie als ein neuartiger Weg, um die Mechanismen der Anästhesie-induzierte Neurotoxizität (AIN) zu studieren. MEAs ermöglichen Echtzeit-Überwachung von in Vivo Aktivität der Neurotransmitter und bieten außergewöhnliche zeitlicher und räumlicher Auflösung. Es wird vermutet, dass die Narkose Neurotoxizität wird teilweise durch Glutamat Dysregulation verursacht und MEAs bieten eine Methode zur Messung der Glutamat. Die neuartige Umsetzung der MEA-Technologie in einem Ferkel-Modell stellt eine einzigartige Gelegenheit für das Studium der AIN.
Jedes Jahr werden Millionen von Kindern Narkose für invasive und nicht-invasive Verfahren in die Vereinigten Staaten1unterzogen. Jahrelang haben die Anästhesie Anbieter Eltern der Sicherheit von Anästhetika, auch bei Kleinkindern und Neugeborenen versichert. Jedoch im Jahr 1999 festgestellt wurde, dass vorübergehende Blockierung des N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Untertyp von Glutamat-Rezeptoren im frühen Leben könnten weit verbreitete neuronale Apoptose in Ratten2verursachen. Vor kurzem veröffentlicht die FDA eine Medikament Sicherheit Kommunikation, die die Etiketten von Anästhetika, enthält eine Warnung über allgemeine Anästhesie und ihre potenzielle negative Auswirkungen auf die entwickelnden Gehirn von Kindern, die jünger als 3 Jahre alt werden muss (US Food und Drug Administration, 2017). Allerdings gibt es immer noch notwendig, mögliche Mechanismen und mögliche neuroprotektive Maßnahmen aufzuklären.
Normale Aktivität der Neurotransmitter wie Glutamat und Gamma-Aminobuttersäure (GABA) sind entscheidend für die normale Neurodevelopment auftreten. Obwohl die meisten der Beteiligten in AIN Bahnen immer noch schwer, dürften Neurotransmitter-Systeme sehr beteiligt sein, da Betäubungsmittel bekannt sind, zu modulieren, diese Wege zu Bewusstlosigkeit zu produzieren. Die exzitatorische Neurotransmitter Glutamat verursacht insbesondere Excitotoxizität, wenn seine Tätigkeit Dysregulated ist. Dieser Neurotransmitter ist normalerweise an Neurogenese, neuronale Plastizität, synaptische und neuronale Wachstum und eine Reihe von anderen kritisch wichtige Gehirnfunktionen beteiligt. Jedoch verursachen längere Aktivierung der GLUTAMATREZEPTOREN Excitotoxizität und neuronale Apoptose, besonders unter Stressbedingungen wie Chirurgie, Sauerstoffmangel und Einsparung von Energie-Verfügbarkeit-3. Bindung von Glutamat an den NMDA Rezeptors nachweislich Na+ und Cl− Zustrom verursachen. Die nachfolgenden Depolarisation wird gedacht, um zu Ca2 + Kanal Öffnung führen und Freisetzung von intrazellulären Ca2 + 4speichert. Diese Dysfunktion wahrscheinlich führt zu einer Kaskade von metabolischen Störungen die schließlich verringern neuronale Verbreitung, Entzündung zu erhöhen und zu neuronalen Tod führen. Trotz dieser Hypothesen bleiben die wahren Mechanismen von AIN unklar5. Wegen seiner Rolle bei der Apoptose stellt Glutamat Dysregulation einen neuartigen Weg, der auf den Mechanismus der bisher dokumentierten neuronale Apoptose, ein Merkmal der AIN beitragen können.
Eines der Hindernisse auf die Untersuchung der neuronalen Prozessen ist ihre hohe Komplexität, vor allem in der Umgebung der neuronalen Entwicklung. Die ersten Monaten des Lebens sind die Zeit der maximalen Anfälligkeit für Verletzungen, während die meisten der wichtigen Schritte der neuronalen Entwicklung wie physiologische Apoptose (neuronale Rebschnitt), Synaptogenese, Gliogenesis und Myelinisierung nehmen Platz6 . Angesichts der komplexen Natur der neuronale Kommunikation und die Schwierigkeit, diese Prozesse zu studieren, ohne Störung der normalen Funktion der CNS, wurden neue Technologien entwickelt, die darauf abzielen, die in Vivo -Erkennung und Quantifizierung von wichtige Elemente der neuronale Kommunikation.
Enzym-linked MEA Technologie diente in dieser Studie als ein neuartiger Weg, um die Mechanismen von AIN in einem klinisch relevanten Ferkel-Modell zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um komplexe in Vivo elektrochemische Vorgänge im Gehirn, einschließlich Glutamat Dysregulation zu studieren. Der eingebaute 4-Kanal platinenaufnahme Sites von MEAs (2 Glutamat-Sensitive-Sites und 2 Sentinel Sites) ermöglichen verweisen auf sich selbst, was dazu beiträgt, Erkennungsgenauigkeit. Darüber hinaus eine Ausgrenzung ist für jede Elektrode aufgetragen, Verleihung Selektivität durch verhindern, dass andere störende Moleküle erkannt7. Darüber hinaus ermöglicht die niedrige Bauform der MEA minimal Gewebetrauma im Vergleich zu älteren Technologien. Diese gleiche Funktion verleiht MEAs eine höhere räumliche Auflösung, die die Studie der mikroskopischen Regionen im Gehirn erleichtert. Beispielsweise können einzelne Regionen des Hippocampus (dentate Gyrus, CA1, CA2) speziell studierte8sein. Einzelheiten auf der Funktionalität von MEAs wurden zuvor beschriebenen9.
Im Vergleich zu MEA Elektrochemie Mikrodialyse enthält eine Membran zwischen der Lösung von Interesse und eine Lösung ähnlicher Zusammensetzung, was die Erkennung der extrazellulären Flüssigkeit ändert10. Obwohl Mikrodialyse eine tragende Säule der Neurochemie ist und ist seit langem für die Erkennung von Neurotransmittern verwendet, hat es den Nachteil der geringen zeitlichen Auflösung, verzögerte Erkennung der Glutamat-Änderung und wesentliche Gewebe Trauma11.
MEAs erkennt indirekt Neurotransmitter wie Glutamat, Acetylcholin und Cholin, mithilfe von entsprechenden Oxidase-Enzyme, die produzieren Elektroaktive Reporter Moleküle wie H2O2 oder O212,13 .
MEA-Technologie hat bei Ratten und Primaten für das Studium der Neurotoxizität im Zusammenhang mit der pathophysiologischen Prozesse als AIN7,14verbreitet. Bei einigen dieser pathophysiologischen Prozesse wurde MEA Technologie verwendet für die Erforschung der Alzheimer-Krankheit, Epilepsie, Schädel-Hirn-Verletzungen und die Wirkung von pharmakologischen Substanzen auf synaptische Kommunikation8,15 , 16 , 17. Obwohl MEAs verwendet wurden, um diese Krankheiten bei Ratten und Primaten zu studieren, die hohe Entwicklungs Ähnlichkeit zwischen Mensch und Ferkel Gehirn Macht der Anpassung der MEA-Technologie bei Ferkeln eine sehr geeignete Technik für das Studium AIN Mechanismen18.
Von Beginn des Experiments werden das Ferkel physiologischen Homöostase eingehalten wie in dieser Übungseinheit Vorveröffentlichung21beschrieben. Minimale Überwachung gehören Pulsoximetrie, Elektrokardiographie, capnographie, nichtinvasive Blutdruck und Temperatur. Ausgebildete Ermittler sind erforderlich, damit physiologische Störungen (z.B., Hypo-/Hyperthermie, Hypoxie, Hypotonie, Herzrhythmusstörungen) entsprechend korrigiert werden können.
Vor Induktion in-vitro- MEA Kalibrierungen werden durchgeführt, um Funktionalität und Selektivität der MEA unter bekannten Bedingungen zu schaffen. Die Kalibrierung und Beschichtung von MEAs ist entscheidend für die effektive Nutzung der Technologie. Es gibt viele mögliche Fehler, die während der Kalibrierung auftreten können. Kalibrierung erkennen diese Probleme sowie unsachgemäße Beschichtung, die falsche interferent Antwort führt. Eine detailliertere tabellarische Darstellung der MEA Reaktion auftretende Fehler kompiliert wurde, entlang mit bemerkenswerten Ursachen und Lösungsvorschläge, welche erweisen sollte ein nützliches Instrument zur wahrscheinlich Fehlersuche (Tabelle 1). Es ist wichtig zu beachten, dass vor der Kalibrierung und Beschichtung, der Glaselektrode Verweis auf das Vorhandensein von Luftblasen oder weiße Verfärbungen geprüft werden soll, da entweder MEA Funktion und Genauigkeit Aufnahme negativ beeinflussen.
Symptom | Ursache | Korrekturmaßnahmen |
Kein Signal | Nicht angeschlossene Elektrode | Elektrode an Headstage und Headstage zum schnellen strommesstechnik System richtig anschließen. |
Keine Stromversorgung des Systems schnell strommesstechnik | Power-Schalter auf der Rückseite schnelles System einschalten | |
Signal-Rausch | Elektrode mit Blut kontaminiert | Bewässern Sie kontinuierlich die Gehirn-Oberfläche beim Einsetzen der Elektrode |
Spülen Sie die Elektrode in dH2O | ||
Enzym-Beschichtung ist locker | Reinigen und die Elektrode überstreichbar | |
Referenzelektrode wurde nicht eingefügt oder beschichtet | Beschichten Sie und legen Sie die Bezugselektrode weiter unter der Kopfhaut | |
Elektrode ist Bewegung des Gehirns Oberfläche erkennen. | Dies tritt normalerweise in oberflächliche Strukturen. Legen Sie wenn möglich die Elektrode tiefer (1 mm zu einem Zeitpunkt) | |
Tierbewegung | Tier ist unzureichend gesichert | Bewegen Sie das Tier in posterior, besser zu schützen Earbars auf dem Schädel. Falls erforderlich, erhöhen Sie den Torso, um bessere Körperhaltung zu ermöglichen. |
Tier ist unzureichend betäubt | Überprüfen Sie die Integrität der Narkose Ausrüstung. Titrieren Sie die Narkose auf eine wirksame Dosis und verwalten Sie eine intramuskuläre Rocuronium Dosis (5 mg/kg) | |
Platzierung der ungenauen Elektrode | Elektrode ist nicht korrekt ausgerichtet. | Passen Sie die Elektrode unter Beibehaltung der richtigen Anschluss an die Headstage. |
Stereotaktischen Koordinaten sind ungenau | Sicherstellen Sie, dass die Ferkel Atlas referenzierten nicht ein weiterer Bezugspunkt oder Flugzeug der Ausrichtung verwenden. | |
Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Nahtstellen zu verschleiern, erzielte er den Schädel. |
Tabelle 1: Anleitung zur Problembehandlung MEA verwenden bei Ferkeln. Mögliche Ursachen und Abhilfemaßnahmen bei Optimierung und Fehlerbehebung helfen.
Stereotaktischen Atlas für die Ferkel dient zur Bestimmung der stereotaktischen Koordinaten des Bereichs des Interesses in Bezug auf einen bekannten wie Bregma18. Ohr Bars sollten ordnungsgemäß gesichert werden, um sicherzustellen, dass der Schädel eben und komplett bewegungsunfähig ist. Vorsicht während der Mittellinie Schnitt der Kopfhaut zu vermeiden, erzielte des Schädels, da diese Visualisierung der Nahtlinien beeinflussen kann. Die Kraniotomie Fenster sollte groß genug für die MEA.
Dieses Protokoll stellt eine Reihe von technischen Herausforderungen, die eine gut ausgestattete op-Abteilung und ein Ermittler/Team geschickt in die OP und Narkose Aspekte des Protokolls erfordern. Das Modell stellt zusätzlich finanzielle Einschränkungen, dass die Ferkel-Modell teurer als das Nagetier-Modell ist; Es ist jedoch wesentlich kostengünstiger als der Einsatz von nicht-humanen Primaten, die Tausende von Dollar Kosten können. Die Verwendung von MEA Technologie stellt ihre eigenen Herausforderungen, wie das Verfahren der Beschichtung und Beschichtung der Elektroden manuell erfordern einen qualifizierten Prüfer oder Assistenten um ausreichende Selektivität und zuverlässige Funktion zu gewährleisten. Die Mikroelektroden selbst sind zerbrechlich, wie sie sind aus Keramik gefertigt und somit leicht beschädigt, wenn angemessene Vorsicht nicht beachtet wird. Mikroelektroden sind Interferenzen von anderen elektrischen Geräten, die Rauschen in Aufnahmen erstellen können, und vom Blut an die Operationsstelle, die Aufnahme Seiten verdecken kann. Die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung stellt eine zusätzliche Belastung wie ein chirurgische stereotaktischen Rahmen gebaut, um die Ferkel Schädel während der Implantation zu immobilisieren benutzerdefinierte sein muss. Der stereotaktischen Rahmen, Glutamat-Oxidase und die Elektroden selbst sind alle teuer. Darüber hinaus stellt das Fehlen eines Ferkels stereotaktischen Atlas von innerhalb der letzten Dekade technische Einschränkungen, die eine besonderen Expertise zu bestimmen, die besondere Lage von tiefen Strukturen im Gehirn Ferkel erfordern. Entwicklung eines neuen stereotaktischen Atlas, vielleicht mit Magnet-Resonanz-Tomographie, würde die Fähigkeit, diese Technologie bei Ferkeln erheblich verbessern.
Das Ferkel ist eine klinisch relevante Modell für die Untersuchung von AIN weitgehend durch die parallelen, die zwischen dieser Spezies und das menschliche Neugeborene bestehen beide ähnliche Gehirnstruktur und Entwicklung besitzen. Im Gegensatz zu häufig verwendeten Modelle wie Mäusen oder Ratten hat die Ferkel eine größere CNS Ähnlichkeit mit Menschen, das für die Übersetzbarkeit der Modellergebnisse eignet. Das Ferkel-Modell ist außerdem billiger und unkomplizierter Handhabung als ein nicht-menschlichen Primaten-Modell beinhaltet. Das Ferkel-Modell soll den Prozess untersuchen, durch welche Narkose könnte induzieren Entwicklungsstörungen Neurotoxizität, messen ihren Beitrag zu neurologische Schäden und bekämpfen das Problem der Schäden, die durch Störfaktoren Variablen. Zum Beispiel kann Hypoxie missverstanden werden, für Schäden, die durch Anästhetika wie es globale Auswirkungen auf das Gehirn hat. Das Ferkel wird genutzt, mit der gleichen op und Narkose Bedingungen wie in der Humanmedizin verwendet, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
Die Verwendung von Keramik-MEA Technologie beseitigt einige der Nachteile der modernen Technik der Mikrodialyse zugeordnet. Mikrodialyse hat eine begrenzte zeitliche und räumliche Auflösung im Vergleich zu amperometrischen Methoden wie die MEA, die kontinuierlich in mehreren Glutamat Ereignisse aufzeichnen kann, mikroskopischen Regionen um bis zu 10 Hz23. Diese schnelle Abtastrate beseitigt die verwirrende Faktor der lokalisierten Neurotransmitter Diffusion, die langsam-Sampling Methoden wie Mikrodialyse24innewohnt. Darüber hinaus ist die MEA eine weniger invasive Methode als eine Sonde, Mikrodialyse, die kann dazu führen, dass erhebliche Gliosis während des Einfügens und Neurotransmitter Aktivität bei der Einfügung Seite22verändern kann.
Frühere Studien nutzen eine Reihe von Säugetieren Modelle, Messtechnik und Regionen des Gehirns, zeigten basale Glutamat Ebenen vergleichbar sind mit dieser Technik zu finden. Dies deutet darauf hin, dass MEA Technologie, wenn das Ferkel-Modell angepasst gültige Aufnahmen der in Vivo Glutamat-Konzentration (Tabelle 2 bietet).
Autor (Jahr) | Aufnahmetechnik | Tiermodell | Alter | Gehirn Region(en) | Meine basale Glutamat-Konzentration (µM) |
Hascup Et Al. (2008)23 | MEA (Enzym-basiert) | Nagetier | 20 – 24 Wochen | Präfrontalen Kortex, Striatum | 3.3 ± 1,0; 5,0 ± 1,2 |
Hascup Et Al. (2010)25 | MEA (Enzym-basiert) | Nagetier | 3 – 6 Monate | Hippocampus | 4.7-10,4 |
Rutherford Et Al. (2007)9 | MEA (Enzym-basiert) | Nagetier | 3 – 6 Monate | Präfrontalen Kortex, Striatum | 44,9 ± 4,7; 7.3 ± 0,9 |
Miele Et Al. (1996)26 | Mikrodialyse (Enzym-basiert) | Nagetier | – | Striatum | 3.6 ± 0,5 |
Day Et Al. (2006)27 | MEA (Enzym-basiert) | Nagetier | 3 – 6 Monate | Frontalen Kortex, Striatum | 1,6 ± 0,3; 1,4 ± 0,2 |
Quintero Et Al. (2007)28 | MEA (Enzym-basiert) | Nicht – Primaten | 5,3-5,5 Jahre | Prämotorischen Kortex, motorischen Kortex | 3.8 ± 1,7; 3,7 ± 0,9 |
Stephens Et Al. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | Nicht – Primaten | 11 – 21 Jahre | Putamen | 8,53 |
Kodama Et Al. (2002)30 | Mikrodialyse (Enzym-basiert) | Nicht – Primaten | – | Präfrontalen Kortex | 1.29-2.21 |
Galvan Et Al. (2003)31 | Mikrodialyse (Enzym-basiert) | Nicht – Primaten | Juvenile | Striatum | 28.74 ± 2.73 |
Während und Spencer (1993)32 | Mikrodialyse (Enzym-basiert) | Menschlichen | 18 – 35 Jahre | Hippocampus | 20,3 ± 6,6 |
Reinstrup Et Al. (2000)33 | Mikrodialyse (Enzym-basiert) | Menschlichen | – | Frontalen Kortex | 16 ± 16 |
Cavus Et Al. (2005)34 | Mikrodialyse (Enzym-basiert) | Menschlichen | 15 – 52 Jahre | Neokortex | 2.6 ± 0,3 |
Tabelle 2: Vergleich der basalen extrazellulärem Glutamat Levelsacross verschiedenen Tiermodellen. Einer ausgewählten Überprüfung der Studien, die normale extrazelluläre Glutamat Ebenen in gesunden wach und narkotisierten Tieren mittels Mikrodialyse oder Mikroelektroden etablieren.
Die Verwendung von MEA Technologie zur Überwachung der in Vivo Glutamat Konzentrationen im Ferkel Modell kann für die zukünftige Bewertung der Ferkel neurologischen Outcomes nach Narkose ermöglichen. Überleben Experimente geplant, die ein Verständnis der langfristigen Auswirkungen der Narkose auf die neurokognitiven Wohlbefinden des menschlichen Neugeborenen. Überleben-Experimente ermöglicht es für Verhaltens-Prüfung und Überwachung von Glutamat ändert sich lange nach der Narkose Exposition. Es ist auch üblich für Kinder unterziehen Anästhesie unter Bedingungen, wo können sie physiologische Belastung in Form eines chirurgischen Eingriffs auftreten. Zukünftige Studien den Einfluss der Chirurgie in Bezug auf neurologische Verletzungen und Erhöhung in Neurotoxizität würde eine genauere Modellierung einer gemeinsamen klinischen Einstellung für Kinder ermöglichen. Die Verwendung von alternativen Tiermodellen ist auch möglich, wie die Studie diese verschiedenen Modelle durch chronische Implantation, ermöglicht es uns, Verhaltensänderungen, die Neurotoxizität zugeordnet zu verfolgen. MEA-Technologie selbst ist vielseitig, so dass Zukunftsstudie nicht auf Analyse von Glutamat Ebenen beschränkt werden muss (z.B.GABA, Cholin, Lysin, etc. konnten analysiert werden).
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchte die Beiträge von der University of Kentucky Center for Mikroelektrode Technology (CenMeT) und der Ohio State University Labor Tier Resource Center (ULAR) anerkennen.
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