फ्लोएम और संयंत्र-एसएपी-खिला Hemipteran कीड़ों में आरएनए हस्तक्षेप प्रेरित करने के लिए डबल-असहाय आरएनए मौखिक वितरण विधियों
Summary
यह लेख फ्लोएम में आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) के लिए पौधों की संवहनी ऊतकों के माध्यम से डबल-कतरा आरएनए (dsRNA) के मौखिक वितरण के लिए विकसित उपन्यास तकनीकों को प्रदर्शित करता है कीड़े खिला.
Abstract
फ्लोएम और पौधों को खिलाने वाले कीड़ों फसलों और फलों की अखंडता पर आक्रमण करने के लिए पोषक तत्वों को पुनः प्राप्त, खाद्य फसलों हानिकारक प्रक्रिया में । Hemipteran कीड़ों पौधों की आर्थिक रूप से पर्याप्त कीट है कि फ्लोएम एसएपी पर खिलाने से फसलों को नुकसान के कारण के लिए खाते । ब्राउन marmorated बदबू बग (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) और एशियाई खट्टे psyllid (एसीपी), Diaphorina सिट्री Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) hemipteran कीट कीट उत्तरी अमेरिका में शुरू कर रहे हैं, जहां वे उच्च मूल्य विशेषता, पंक्ति के एक इनवेसिव कृषि कीट हैं, और स्टेपल फसलों और खट्टे फल, साथ ही साथ एक उपद्रव कीट जब वे कुल घर के भीतर । कई प्रजातियों में कीटनाशक प्रतिरोध कीट प्रबंधन रणनीतियों के वैकल्पिक तरीकों के विकास के लिए प्रेरित किया है । डबल-कतरा आरएनए (dsRNA)-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन है कि कीट कीट के प्रबंधन के लिए एक उपकरण के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के लिए एक जीन मुंह बंद करने तंत्र है । Exogenously संश्लेषित dsRNA या छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) अंतर्जात आरएनए के क्षरण के माध्यम से अत्यधिक कुशल जीन मुंह बंद करने को ट्रिगर कर सकते हैं, जो कि प्रस्तुत करने के लिए मुताबिक़ है. hemipteran कीटों के नियंत्रण के लिए आणविक जैव कीटनाशकों के रूप में RNAi के प्रभावी और पर्यावरणीय उपयोग की आवश्यकता है vivo डिलीवरी के माध्यम से dsRNAs की फीडिंग में । यहां हम कीड़ों को dsRNA के वितरण के लिए तरीकों का प्रदर्शन: हरी सेम में विसर्जन द्वारा dsRNA की लोडिंग, और जीन की अवशोषित घूस के माध्यम से मौखिक प्रसव के साथ विशिष्ट dsRNA । हम भी पत्तियों स्प्रे, जड़ सराबोर, ट्रंक इंजेक्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्ले granules, सभी जिनमें से dsRNA के निरंतर जारी करने के लिए आवश्यक हो सकता है का उपयोग कर गैर ट्रांसजेनिक संयंत्र वितरण दृष्टिकोण रेखांकित किया है । मौखिक रूप से घूस dsRNA द्वारा कुशल प्रसव एक प्रभावी खुराक के रूप में इस तरह के किशोर हार्मोन एसिड ओ-methyltransferase (JHAMT) और vitellogenin (वी. पी.) के रूप में लक्षित जीन की अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कमी पैदा करने के लिए पुष्टि की थी । इन अभिनव तरीकों dsRNA के वितरण के लिए फसल संरक्षण में उपयोग और कीट प्रबंधन के लिए पर्यावरणीय चुनौतियों से उबरने के लिए रणनीतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Introduction
Hemipteran कीटों में सबसे अधिक जनसंख्या वृद्धि और पौधों में फैलने वाली बीमारियों को प्राप्त करने के लिए उनकी क्षमता के agriculturebecause के आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट शामिल हैं । BMSB, एच halys Stål, एक आक्रामक कीट है कि गलती से Allentown में पश्चिमी गोलार्द्ध में शुरू किया गया था, एशिया से पेंसिल्वेनिया (चीन, ताइवान, कोरिया, और जापान) पहली sighting के साथ १९९६1में सूचना दी । अपनी शुरूआत के बाद से, BMSB ४३ राज्यों में पाया गया है, मध्य अटलांटिक में सबसे अधिक आबादी के साथ (DE, एमडी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, एनजे, VA, और वेस्ट वर्जीनिया), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कनाडा और यूरोप में, और कृषि के लिए एक संभावित खतरे का प्रतिनिधित्व करता है2। एक polyphagous कीट के रूप में, BMSB उच्च मूल्य फसलों जैसे सेब, अंगूर, सजावटी पौधे, बीज फसलों, सोयाबीन, और मकई सहित लगभग ३०० की पहचान की संयंत्र मेजबान को नुकसान भड़काने कर सकते हैं । नुकसान मुख्य रूप से रुखा और फ्लश के रूप में जाना जाता है जहां पशु अपनी सुई की तरह stylet के साथ मेजबान फसल संवहनी ऊतकों2,3से पोषक तत्वों का उपयोग करने के लिए लाभ के रूप में जाना जाता खिला की विधा के कारण होता है । BMSB भी एक इनडोर कीट के रूप में वे ऐसे स्कूलों और घरों में सर्दियों के माध्यम से शरद ऋतु के दौरान2के रूप में रहने वाले क्षेत्रों में निवास मिल सकता है । BMSB द्वारा जारी रसायनों और aeroallergens फलों की फसल श्रमिकों में अवैध एलर्जी की प्रतिक्रिया को सूचित किया गया । BMSB भी संवेदनशील व्यक्तियों4,5में जिल्द की सूजन, नेत्रश्लेष्मलाशोथ, और rhinitis के लिए अग्रणी एलर्जी रोग के लिए योगदान कर सकते हैं । एक अन्य hemipteran कीट, एसीपी, डी. सिट्री Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), खट्टे फलों का एक गंभीर कीट है, और फ्लोएम सीमित जीवाणुओं (कैंडिडेटस Liberibacter asiaticus) के कारण Huanglongbing (HLB) को पहुंचाता है, बेहतर ज्ञात खट्टे हरियाली रोग के रूप में6,7. HLB पहले दक्षिणी चीन से सूचित किया गया था और ४० विभिंन एशियाई, अफ्रीकी, Oceanian, दक्षिण और उत्तर अमेरिकी देशों के7में फैल गया है । खट्टे हरियाली खट्टे फल हानि के कारण आर्थिक और वित्तीय घाटे की धमकी के साथ एक विश्वव्यापी समस्या है; इसलिए, एसीपी के प्रबंधन को रोकने और HLB को नियंत्रित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण माना जाता है ।
इन कीट कीट के प्रभावी नियंत्रण के लिए उपाय आमतौर पर रासायनिक कीटनाशकों के आवेदन की आवश्यकता होती है जो अपेक्षाकृत कम रहते हैं । रासायनिक कीटनाशक नियंत्रण रणनीतियों अक्सर सुरक्षित पर्यावरण प्रबंधन रणनीतियों की कमी है या कीट आबादी8,9में कीटनाशक प्रतिरोध के कारण संवेदनशीलता में कमी आई है । इसलिए, आणविक जैव कीटनाशकों के साथ कीट के जैविक नियंत्रण एक संभावित विकल्प है, लेकिन इसके उपयोग विश्व स्तर पर मामूली बनी हुई है, और परजीवी की विभिन्न प्रजातियों (जैसे, Trisolcus japonicus) भी प्रभावी हो सकता है के रूप में प्राकृतिक जैविक नियंत्रण. RNAi आणविक जैव कीटनाशकों के साथ इनवेसिव कीट कीट के प्रबंधन के लिए एक संभावित उभरती हुई प्रौद्योगिकी है10। RNAi एक अच्छी तरह से वर्णित जीन विनियामक तंत्र है कि अंतर्जात के प्रभावी posttranscriptional जीन मुंह बंद करने की सुविधा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अनुक्रम में dsRNAs हमला विशेष तरीके से, कि अंततः mRNA में जीन अभिव्यक्ति के विनियमन की ओर जाता है तर११,१२. संक्षेप में, जब exogenous dsRNA एक कोशिका यह siRNAs में bidentate nuclease RNase III superfamily के एक सदस्य द्वारा संसाधित किया जाता है में आंतरिक है, Dicer कहा जाता है, जो कीड़े में संरक्षित evolutionarily है, मक्खियों, पौधों, कवक, और स्तनधारियों13, 14 , 15. ये 21-25 न्यूक्लियोटाइड सिरना डुप्लेक्स तब जख्मी और एकीकृत आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने कॉम्प्लेक्स (RISC) में मार्गदर्शक RNAs के रूप में हैं । यह RISC-आरएनए कॉम्प्लेक्स वाट्सन-क्रिकेटरों आधार को पूरक लक्ष्य mRNA में बाँधने की अनुमति देता है; यह अंततः Argonaute प्रोटीन, एक बहु डोमेन एक RNase एच-डोमेन, जो इसी mRNA नीचा और प्रोटीन अनुवाद कम कर देता है, जिससे posttranscriptional जीन मुंह बंद करने के लिए अग्रणी युक्त प्रोटीन द्वारा दरार की ओर जाताहै 16 , 17 , 18.
कीट प्रबंधन के लिए RNAi हित के जीन मौन करने के लिए vivo में dsRNA के परिचय की आवश्यकता है, जिससे सिरना मार्ग को सक्रिय. विभिंन तरीकों कि कीड़ों और कीट कोशिकाओं को dsRNA वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रणालीगत RNAi10,19, भिगोने20,21, microinjection22, वाहकों जैसे liposomes खिला शामिल 23, और अंय तकनीकों24। RNAi पहले Caenorhabditis एलिगेंस में unc-22 आग और मेलो25द्वारा जीन अभिव्यक्ति, frizzled Drosophila26में melanogaster जीन की अभिव्यक्ति में पछाड़ना द्वारा पीछा प्रदर्शन किया गया । प्रारंभिक कार्यात्मक अध्ययन dsRNA कीड़ों में उद्धार करने के लिए उपयोग microinjection, जैसे कि Apis अफ्रिकन22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, एच halys30, और lepidopteran कीड़े (Terenius एट अल द्वारा समीक्षित । 31). Microinjection कीट में ब्याज की साइट के लिए एक सटीक और सटीक खुराक देने के लिए लाभप्रद है । हालांकि इस तरह के सेप्टिक पंचर प्रतिरक्षा संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को३२आघात के कारण, इसलिए, कृषि जैव कीटनाशक विकास में अपनी व्यावहारिकता सत्तारूढ़ बाहर निकाल सकते हैं ।
dsRNA vivo में पहुंचाने की एक और विधि भिगोने द्वारा है, जो dsRNA युक्त extracellular माध्यम में आम तौर पर पशुओं या कोशिकाओं के निलंबन के द्वारा घूस या dsRNA के अवशोषण शामिल है । भिगोने के लिए कुशलतापूर्वक Drosophila S2 ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में RNAi प्रेरित इस्तेमाल किया गया है के बहाव को बाधित-Raf1 (DSOR1) mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे कळेनासे (MAPKK)20, के रूप में अच्छी तरह के रूप में सी. एलिगेंस में मौन करने के लिए पीओएस-1 जीन३३। हालांकि, dsRNA भिगोने का उपयोग कर दिया कम कुशल है RNAi प्रेरित करने के लिए microinjection20की तुलना में । एक चबाने कीट में RNAi मध्यस्थता मुंह बंद करने पहले पश्चिमी मकई rootworm (WCR)(Diabrotica virgifera virgifera) में एक कृत्रिम आगरआहार10 में dsRNA को infusing द्वारा दिखाया गया था । इससे पहले रिपोर्टों को संक्षेप में प्राकृतिक आहार में संचार dsRNA देने के लिए arthropods३४के लिए विशिष्ट है । इन वितरण विधियों को आगे की डिलीवरी के कृत्रिम साधन के लिए तुलना में प्रभावी होना निर्धारित किया गया; जैसे tsetse मक्खी के मामले (Glossina morsitans morsitans), जहां एक प्रतिरक्षा से संबंधित जीन के बराबर पछाड़ना मनाया जब dsRNA या तो रक्त भोजन या microinjected३५के माध्यम से दिया गया था । इसी प्रकार, हल्के भूरे रंग के सेब मोठ (Epiphyas postvittana)३६, diamondback मोठ (Plutella xylostella) लार्वा३७में बूंदों के माध्यम से dsRNA का वितरण, साथ ही शहद मधुमक्खियों का३८,३९ प्रेरित कुशल RNAi । hemipteran में सबसे प्रभावी RNAi प्रयोगों dsRNA४० के इंजेक्शन का उपयोग किया है क्योंकि hemipteran कीड़ों में dsRNA के मौखिक प्रसव के बाद से यह मेजबान संयंत्र के संवहनी ऊतकों के माध्यम से दिया जाना चाहिए दुरूह है । प्रभावी RNAi भी एसीपी और ग्लास्ड निशानची लीफ़हॉपर (GWSS), Homalodisca vitripennisमें मनाया गया था: dsRNA खट्टे और दाखलताओं कि जड़ सराबोर, dsRNA के माध्यम से संवहनी ऊतकों में पत्तियों अवशोषित था के माध्यम से दिया गया था काटने के द्वारा स्प्रे, ट्रंक इंजेक्शन, या अवशोषण४१,४२,४३,४४,४५,४६। यह भी एसीपी (२०१६, यूएस २०१७०२११०८२ A1) के खिलाफ dsRNA के लिए पहले पेटेंट के परिणामस्वरूप । सिरना और dsRNA के वितरण जैसे नैनोकणों और liposomes प्रदान स्थिरता के रूप में वाहक का उपयोग कर, और बढ़ा dsRNA प्रभावकारिता में वृद्धि तेजी से उभरते हैं23,४७,४८,४९ ,५०. nanoparticle के एक नए वर्ग के लिए इन विट्रो में न्यूक्लिक एसिड के लिए और vivo है कि विशेष रूप से चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए संक्षेप में उपयुक्त वितरण वैक्टर५१के रूप में अपार क्षमता प्रदान कर सकते है के लिए वितरण वाहनों पर आधारित है । dsRNA के लिए एक प्रसव के वाहन के रूप में नैनोकणों घुलनशीलता, hydrophobicity, या सीमित५२संचय सहित नुकसान हो सकता है, लेकिन एक उपयुक्त बहुलक सहायता वितरण इन नुकसान भरपाई कर सकते हैं । स्व-आफ्ना न्यूक्लियोटाइड का विकास और उपयोग भी ‘ antisense oligonucleotides ‘ नामक उभरते हैं, जो एकल कतरा आरएनए/डीएनए डुप्लेक्स४६हैं ।
arthropods में Vitellogenesis प्रजनन को नियंत्रित करने और किशोर हार्मोन (जैक् सन) या ecdysone द्वारा विनियमित एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, जो शरीर में वसा द्वारा वी. आर. के संश्लेषण की प्रमुख उत्प्रेरणा हैं; वी. जी. वी. द्वारा अंततः विकासशील oocyte द्वारा ली गई है वीजी रिसेप्टर endocytosis५३मध्यस्थता के माध्यम से । वी. जी. polypeptides संश्लेषित extraovarially के एक समूह है, जो प्रमुख अंडे की जर्दी प्रोटीन के विकास के लिए आवश्यक है, vitellin५४,५५, और इसलिए, यह प्रजनन और उंर बढ़ने५६में महत्वपूर्ण है । वी. पी. वी.५७ सूत्रकृमि में सफलतापूर्वक मौन किया गया है के रूप में अच्छी तरह के रूप में हनी मधुमक्खी (Apis अफ्रिकन) में जहां RNAi की मध्यस्थता कमी वयस्कों और अंडे22में मनाया गया था । RNAi मध्यस्थता posttranscriptional वी पी के जीन मुंह बंद करने परीक्षण किया गया था क्योंकि यह सोचा था कि इसकी कमी कम प्रजनन और fecundity के रूप में एक चौकस phenotypic प्रभाव को बढ़ावा मिलेगा, संभावित BMSB नियंत्रण में सहायता के लिए । JHAMT जीन है कि encodes एस-एडेनोसिल-एल-methionine (सैम)-निर्भर जैक् स एसिड O-methyltransferase, catalyzes के अंतिम चरण में जैक् प संश्लेषण मार्ग५८। इस मार्ग में farnesyl pyrophosphate (FPP) क्रमिक रूप से farnesol से बदल जाता है, farnesoic द्वारा जैक् farnesoate के रूपांतरण के बाद एसिड के लिए JHAMT द्वारा । इस मार्ग के कीड़ों और arthropods में विशेष रूप से कायापलट, एक प्रक्रिया है कि विकास के हार्मोन५९,६०,६१द्वारा विनियमित है के लिए संरक्षित है । बी. मोरीमें, JHAMT जीन अभिव्यक्ति और कॉर्पोरा allata में जैक् स की कृत्रिम गतिविधि का सुझाव है कि JHAMT जीन का transcriptional दमन जैक् स के संश्लेषण५८की समाप्ति के लिए महत् वपूर्ण है । इसलिए, JHAMT और वीजी जीन लक्षित RNAi का उपयोग कर कमी के लिए चुना गया । RNAi भी एसीपी और GWSS के नियंत्रण के लिए खट्टे पेड़ों में परीक्षण किया गया था । खट्टे पेड़ों जड़ सराबोर के माध्यम से dsRNA के साथ इलाज किया गया, स्टेम नल (ट्रंक इंजेक्शन), साथ ही कीट विशिष्ट arginine कळेनासे के खिलाफ dsRNAs के साथ पत्तियों स्प्रे (एके) टेप४२,४४। dsRNA के सामयिक आवेदन सभी खट्टे पेड़ों के चंदवा पर पता चला था, पौधों संवहनी ऊतकों के माध्यम से कुशल वितरण का संकेत है, और एसीपी और GWSS में वृद्धि हुई मृत्यु के परिणामस्वरूप४१,४२, ४५.
वर्तमान अध्ययन में, हम ऐसे dsRNA के रूप में उपचार के लिए एक प्राकृतिक आहार वितरण विधि की पहचान की है । इस नए विकसित तकनीक बाद में BMSB अप्सराओं में जीन विशिष्ट dsRNAs का उपयोग कर के रूप में पहले६२का प्रदर्शन JHAMT और वी पी mRNA मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन नए वितरण प्रोटोकॉल का प्रदर्शन यहां पारंपरिक आरएनए वितरण प्रणालियों कि सामयिक स्प्रे या microinjections का उपयोग वृथा । सब्जियों और फलों, स्टेम नल, मिट्टी हीनों, और में मिट्टी शोषक dsRNA, जो जैव कीटनाशक कीट और रोगज़नक़ प्रबंधन के निरंतर विकास के लिए महत्वपूर्ण है की डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
RNAi जीन जैविक समारोह और विनियमन की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित किया है, महान क्षमता के साथ कीट कीट के प्रबंधन के लिए उपयोग किया जा करने के लिए19,६८,६९,?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक आभार डोनाल्ड वेबर और मेगन Herlihy (USDA, ARS Beltsville, प्रबंध निदेशक) BMSB और प्रयोग के लिए एचबी और बनाए रखने के लिए प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं; और मारिया टी गोंजालेज, साल्वाडोर पी लोपेज, (USDA, ARS, फोर्ट पियर्स, fl) और जैकी एल मेट्ज़ (फ्लोरिडा के विश्वविद्यालय, फोर्ट पियर्स, fl) कॉलोनी रखरखाव, नमूना तैयारी, और विश्लेषण के लिए ।
Materials
| BMSB (H. halys) insects | USDA | ||
| ACP (D. citri) insects | USDA | ||
| organic green beans | N/A | ||
| Citrus plants | USDA | ||
| sodium hypochlorite solution | J.T. Baker | ||
| green food coloring | McCormick & Co., Inc | ||
| Thermo Forma chambers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Magenta vessel (Culture) | Sigma | ||
| Primers | IDT DNA | ||
| SensiMix SYBR | Bioline | ||
| qPCR ABI 7500 | Applied Biosystems | ||
| Spray bottle | N/A | ||
| Parafilm | American Can Company | ||
| TaKaRa Ex Taq | Clontech | ||
| QIAquick | Qiagen |
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