РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих
Summary
Этот метод выпадающее РНК позволяет определить цели РНК длиной некодирующих РНК (lncRNA). Основываясь на гибридизации домашнего, разработанные анти чувство ДНК олигонуклеотида зондов для этой lncRNA в надлежащим образом фиксированной ткани или клетки линии, позволяет эффективно захвата всех целей РНК lncRNA.
Abstract
Длиной некодирующих РНК (lncRNA), которые являются последовательности более чем 200 нуклеотидов без рамки определенных чтения, принадлежат к семейству регулирования некодирующих РНК. Хотя их биологические функции остаются практически неизвестны, постоянно увеличивалось количество этих lncRNAs и теперь предполагается, что люди могут иметь более чем 10 000 таких стенограмм. Некоторые из них известны принять участие в важных нормативных пути экспрессии генов, которые происходят на уровне транскрипционный анализ, но и на разных этапах РНК co – и post-transcriptional созревания. В последних случаях РНК, которые являются мишенью для lncRNA должны быть определены. Это причина, почему это полезно разработать метод, позволяющие идентифицировать РНК, связанных прямо или косвенно с lncRNA интерес.
Этот протокол, который был вдохновлен ранее опубликованные протоколы, позволяя изоляции lncRNA вместе с его последовательности связанных хроматина, был адаптирован для изоляции связанных молекул РНК. Мы определили, что два шага имеют решающее значение для обеспечения эффективности этого протокола. Во-первых, разработки конкретных анти смысле ДНК зонды олигонуклеотида состоянии гибридизировать к lncRNA интерес. С этой целью вторичная структура lncRNA было предсказано биоинформатики и анти чувство олигонуклеотидных зондов были разработаны с сильное сродство для регионов, которые отображают низкую вероятность внутреннего низкопробный спаривать. Второй критический шаг процедуры опирается на фиксирующие условий ткани или культивируемых клеток, которые должны сохранить в сети между всеми партнерами, молекулярной. В сочетании с высокой пропускной способностью РНК последовательности, этот протокол выпадающее РНК может обеспечить весь РНК interactome lncRNA интерес.
Introduction
Общая цель метода, описанного здесь заключается в идентификации молекулярных партнеров РНК длиной некодирующих РНК (lncRNA). LncRNA соответствуют последовательности более чем 200 нуклеотидов без рамки определенных чтения. Некоторые из них было показано, чтобы участвовать в регулировании выражения гена, не только на уровне транскрипционный анализ, но и на разных этапах РНК co – и post-transcriptional созревания. В последних случаях молекулярные партнерами lncRNA являются РНК, которые должны быть определены. Будет необходимо разработать метод, позволяющие идентифицировать РНК, связанных прямо или косвенно с lncRNA интерес.
Ранее опубликованные методы, такие как Chromatin изоляции RNA очистки (щебечут)1,2 и захватить гибридизации анализ на РНК цели (диаграмма)3,4, позволяют открытие высокой пропускной способности РНК прыгните белков и геномных привязки сайтов конкретного lncRNA. В этих двух методов, lncRNA интерес был впервые гибридизированных к биотинилированным взаимодополняющих олигонуклеотиды, и комплекс был затем изолированы при помощи стрептавидина бусины. Основное различие между этими двумя методами связана с дизайн зондов, ориентированные на lncRNAs. Щебечут, вдохновленный РНК рыбы, состояла из проектирование бассейна коротких дополнительных зондов олигонуклеотида ДНК плитки по всей длине lncRNA стратегии. Напротив в ДИАГРАММЕ, авторы адаптированы H РНКазы assay сопоставления на lncRNAs сайты, доступные для гибридизации зонда.
Процедура, предложенная здесь дизайн анти смысле ДНК биотинилированным олигонуклеотида использует датчики биоинформатики моделирование lncRNA вторичной структуры5 для выбора зонды с сильное сродство для регионов, которые отображают низкую вероятность внутреннего Базовый сопряжения. Эта процедура имеет преимущество быть менее дорогостоящим, чем те, которые основаны на бассейны черепица олигонуклеотидных зондов2 и меньше времени, чем те, которые основаны на H РНКазы чувствительность4.
Поскольку существует растущее количество доказательств для регулирования post-transcriptional гена lncRNAs6, это очень полезно разработать подход позволяет захвата молекул РНК, которые являются объектами lncRNA. Кроме того чтобы быть пригодным для большинства приложений, подход был оптимизирован в культивируемых клеток и тканей экстрактов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Длиной некодирующих РНК (lncRNAs), их количество и разнообразие представляют большое поле исследований и их роли в основном все еще для того чтобы быть обнаружены. Многие из этих lncRNAs ядерной локализации и среди них, некоторые вовлечены в пути регулирования экспрессии генов посредством транскрипционный анализ или посттранскрипционного механизмов. Один из текущих задач в этой области — понять актуальность этих lncRNAs в post-transcriptional обработки РНК. Для этой цели РНК, мишенью lncRNAs должны быть определены. Вдохновленный предыдущих исследований было сосредоточено на ассоциации lncRNAs с хроматином, мы разработали процедуру, которая позволяет выявить РНК, связанные с lncRNA. Успех этого протокола, названный РНК выпадающее, зависит главным образом от двух важных шагов, а именно дизайн анти смысле ДНК олигонуклеотидных зондов, должны специально и исключительно гибридизировать с lncRNA интерес и в условиях ткани или клетки для фиксации, для сохранения целостности сети между всеми партнерами, молекулярной.
Ранее опубликованные протоколы, предусматриваются процедуры изолировать lncRNA вместе с его связанного хроматина последовательностей (щебечут1,2, диаграмма3,4). В этих протоколах различные стратегии были заняты в разработке зондов олигонуклеотида биотинилированным анти смысле ДНК. В процедуре щебечут авторы использовали бассейн ДНК биотинилированным олигонуклеотидных зондов, охватывающих всю длину lncRNA интерес после исключения всех избыточных и неспецифической зондов1,2. В протоколе диаграммы авторы определили регионы lncRNA, которые являются более доступными для гибридизации и разработан захвата олигонуклеотиды, предназначенных для этих регионов. Эти регионы были выбраны на основе их чувствительность РНКазы-H. Действительно используя свойство РНКазы-H для гидролизуют РНК на сайты связывания РНК-ДНК, олигонуклеотиды, которые гибридизируйте доступных сайтов в lncRNA производят РНК-ДНК гибриды и привести к ферментативного расщепления lncRNA. Авторы трех из этих олигонуклеотиды захвата кандидат выбран и использовали их в коктейль3,4.
Процедура мы использовали, чтобы дизайн анти смысле ДНК биотинилированным олигонуклеотидных зондов был близок к используемому в протоколе диаграммы, но гибридизации доступные регионы желаемого lncRNA не были выбраны на основе их чувствительность РНКазы-H, но Согласно их низкую вероятность внутреннего низкопробный спаривать как определяется биоинформатики моделирование lncRNA вторичной структуры. Необходимо заметил, что различные вторичные структуры будет прогнозироваться с использованием различных алгоритмов, и зонды выбираться должны быть те, которые гибридизируйте доступных последовательностей lncRNA в наибольшее количество вторичных структур предсказал. Те же результаты были получены с помощью коктейль трех разработан, конкретные зондов или единичного пробоотборника индивидуально. Это побудило использование двух отдельных, конкретные зондов и рассмотрение положительных результатов как те, которые являются общими для этих двух зондов. Наконец, поэтому рекомендуется в начале развития метода, для оптимального результата, и чтобы иметь возможность оценить специфичность результатов раскрывающемся дизайн 3 различных анти чувство олигонуклеотида зонды и затем сравнить экспериментально, их эффективность, особенно поскольку зонд эффективности может быть изменено, подготовка lysate клетки. Тем не менее процедура зонд дизайн, основанный на моделирование биоинформатики lncRNA вторичной структуры, которые мы использовали по-прежнему дешевле, чем, основанной на пулах черепица олигонуклеотидных зондов2, и это было меньше времени, чем метод на основе H РНКазы чувствительность4.
Отрицательный контроль также должно выполняться с использованием как негативные захвата олигонуклеотида олигонуклеотида биотинилированным ДНК смысле зондов или платные олигонуклеотидных зондов или олигонуклеотиды, направленных против несвязанных РНК. Из-за существования естественных антисмысловых стенограммы lncRNAs использование олигонуклеотидных зондов смысл иногда может быть неадекватной. Независимо от зонда олигонуклеотида, отобранных для отрицательного контроля необходимо проверить путем взрыва, что он не гибридизируйте с известным РНК и иметь в виду, что этот олигонуклеотида могут скрещиваться до сих пор удаления заметки lncRNA.
Lysates клетки используется в этих экспериментах выпадающее РНК были получены от 106 -107 клеток при работе с культивируемых клеток и от 1 до 10 мг, при работе с ткани. Подготовка lysates клетки необходимо адаптировать в зависимости от типа ткани или клетки, используемый с двух основных шагов, которые должны быть оптимизированы: а именно, сшивки шаг, который позволяет формирование ковалентных связей между lncRNA и его молекулярной партнерами и Sonication шаг, который уменьшает вязкость путем измельчения хроматина.
Цель cross-linking шаг является обеспечить, чтобы все РНК цели остаются закрытыми для lncRNA, вызывая формирование сети между всеми партнерами, молекулярные. Параформальдегида лечения шаг, который будет образуют ковалентные связи между lncRNA и его партнерами позволяет сети быть сетчатые. В протоколе диаграммы, было предложено при работе с ядерными lncRNA, для выполнения первой процедуры с параформальдегида ячейки в целом lysate и второй лечение изолированных нуклеиновых фракция3,4. Мы наблюдали этот дополнительный шаг снизилась эффективность зондов, вероятно путем сокращения доступности lncRNA в клетках. Следовательно степени ретикуляции, параформальдегид должен быть адаптирован с учетом клетки или ткани типа используется, локализации lncRNA интерес и эффективности разработанных датчиков.
Во время лизировать клетки, хроматина выпущена в lysate и увеличивает его вязкость; Это необходимо лоскуток хроматина, sonication для увеличения текучести образцов и таким образом облегчить доступность олигонуклеотидных зондов к lncRNA интерес. Однако sonication также будет перерабатывать РНК, экстрагируют lncRNA интерес. То важно свести к минимуму время sonication таким образом, что в то время как она эффективно уменьшает вязкость lysate, она также позволяет получение РНК фрагменты с длиной состоит между 200-800 bp. Обратите внимание, что sonication время будет весьма в зависимости от количества и типа ткани или клетки культивировали.
В заключение описанную здесь процедуру позволяет в 2-3 дня захвата целей РНК желаемой lncRNA. В сочетании с RT-ПЦР, эти методы позволят ищет конкретной ассоциации и регулирование мРНК, желаемого lncRNA как кандидат подход. Геном широкий подход РНК выпадающее эксперименты могут быть проанализированы по высокой пропускной способностью РНК последовательности позволяет извлечения всех РНК, связанные с желаемой lncRNA. Независимо от аналитической выбранной стратегии, РНК выпадающее процедура должна представить новые значительные знания о РНК регулирования по lncRNAs.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана университета Экс-Марсель и CNRS и финансируется грантом от Pfizer лабораторий.
Materials
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
| Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
| Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
| Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
| RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
| Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
| Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
| Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |
Referencias
- Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol Cell. , 667-678 (2011).
- Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp. , e3912 (2012).
- Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).
- Simon, M. D. Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART). Curr Protoc Mol Biol. , (2013).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions. Biochem J. , 2925-2935 (2017).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).
- Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., König, J., Hortobágyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nat Neurosci. , 452-458 (2011).
- Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis. Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).
- Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O’Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states. Sci Rep. , 40127 (2017).
- Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity. Nat Med. , (2016).
- Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer. Oncotarget. , (2017).
- Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., François-Bellan, A. M. Circadian RNA expression elicited by 3′-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. Elife. , (2016).
- Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. Alu element-mediated gene silencing. EMBO J. , 1694-1705 (2008).
- Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Mol Cell. , 925-938 (2010).
- Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites. Cell. , 188-199 (2014).
- Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice. RNA. , (2012).
- Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult. Cell Rep. , 111-123 (2012).
- Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
