Implantación de la cánula en la Cisterna Magna de roedores
Summary
Aquí se describe un protocolo para realizar la canulación de cisterna magna (CMc), una forma mínimamente invasiva para ofrecer marcadores, sustratos y moléculas de señalización en el líquido cerebroespinal (CFS). Combinado con diferentes modalidades de imágenes, CMc permite sistema de glymphatic y evaluación dinámica de CSF, así como entrega de todo el cerebro de varios compuestos.
Abstract
Canulación de cisterna magna (CMc) es un procedimiento sencillo que permite acceso directo al líquido cefalorraquídeo (LCR) sin daños operativos en el cráneo o el parénquima cerebral. En roedores anestesiados, la exposición de la duramadre por disección Roma de los músculos del cuello permite la inserción de una cánula en la cisterna magna (CM). La cánula, compuesta por una fina aguja biselada o borosilicate capilar, está conectada a través de un tubo de polietileno (PE) a una jeringa. Utilizando una bomba de jeringa, las moléculas pueden entonces inyectar a precios controlados directamente en la CM, que es continuo con el espacio subaracnoideo. Desde el espacio subaracnoideo, podemos rastrear flujos de CSF por flujo convectivo en el espacio perivascular alrededor de las arteriolas penetrantes, donde se produce el intercambio de solutos con el líquido intersticial (ISF). CMc se puede realizar inyecciones agudo inmediatamente después de la cirugía, o para la implantación crónica, con posterior inyección en anestesiados o despierto, moviendo libremente roedores. Cuantificación de la distribución del trazador en el parénquima cerebral se puede realizar por epifluorescencia, 2 fotones microscopía y resonancia magnética (MRI), dependiendo de las propiedades fisico-químicas de las moléculas inyectadas. Así, CMc junto con diversas técnicas de imagen ofrece una poderosa herramienta para la evaluación del sistema de glymphatic y dinámicas de la CFS y la función. Por otra parte, el CMc puede ser utilizada como un conducto para la entrega rápida y todo el cerebro de sustratos metabólicos que de lo contrario no podrían cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y moléculas de señalización.
Introduction
Líquido cefalorraquídeo (LCR) baña el sistema nervioso central (SNC) en todo el sistema ventricular y a lo largo de los espacios subaracoideos, un espacio anatómico definido en continuo con los ventrículos, que rodea el cerebro y la médula espinal. Una de las principales funciones de la CSF debe proporcionar una ruta para la separación de metabolitos y solutos de la parenquimia del cerebro. Separación es facilitada mediante el glymphatic recientemente descubierto sistema1, el cerebro análogo al sistema linfático periférico. Adjunto, describimos y discutimos la cisterna magna la canulación (CMc), un método mínimamente invasivo para la entrega directa de las moléculas en el LCR. El CMc es el método fundamental para estudiar la función glymphatic. Además, CMc puede aplicarse también para el estudio de la dinámica de la CSF y para una entrega rápida y todo el cerebro de moléculas permeables de barrera (BBB) de cerebro sin sangre en el parénquima cerebral, a lo largo del espacio perivascular.
El CMc explota principios fisiológicos de dinámicas de movimiento de la CFS a través del CNS para entregar trazalíneas etiquetados moléculas o fármacos en el espacio lleno de CSF de la cisterna magna (CM). Las moléculas se inyectan a través de una cánula que se implanta en el revestimiento de la membrana dural atlanto-occipital CM. moléculas después son llevadas por el flujo de la CFS a granel en la parenquimia del cerebro mediante el espacio paravascular del1. Agente trazador o contraste inyectado a través de la CMc sigue el movimiento del LCR, que permite la evaluación de la CSF movimiento y afluencia de glymphatic mediante la cuantificación de niveles de intensidad de moléculas marcadas que entran en el parénquima cerebral. CMc es compatible con diferentes técnicas de imagen incluyendo epifluorescencia, 2 fotones microscopía y la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). También, esta evaluación se puede realizar en vivo o ex vivo. Lo importante, CMc permite la visualización del sistema glymphatic bajo anestesia o durante el sueño natural, así como en animales despiertos, libremente móviles.
La técnica de CMc puede ser utilizada para estudiar diferentes aspectos de la dinámica de fluidos en el LCR, pero ha demostrado para ser particularmente útiles para estudiar el sistema de glymphatic. Glymphatic actividad conduce el flujo convectivo de LCR desde el espacio periarterial mediante canales de agua Acuaporina-4 (AQP-4), que están anclados en la membrana de astrocytic envoltura vascular endfeet. El flujo convectivo permite el intercambio de LCR y líquido intersticial (ISF) dentro de la parenquimia del cerebro. CSF/ISF que contiene solutos y desechos metabólicos se elimina entonces de la parenquimia del cerebro vía los perivenous espacio2,3. En última instancia, CSF/ISF llega a la periferia a través de los vasos linfáticos dural recientemente descrito4,5. El sistema glymphatic se ha demostrado fundamental para la separación de metabolitos residuales nocivos como amiloide-β2. Además, separación de glymphatic se deteriora en envejecimiento6, después de lesión de cerebro traumática7y en modelos animales de diabetes8 y9de la enfermedad de Alzheimer. En particular, glymphatic actividad es estado dependiente, que muestra significativamente mayor actividad durante el sueño o la anestesia en comparación con la vigilia1. De hecho, anestesiados los animales jóvenes presentan mayor actividad glymphatic. Así, cuantificación experimental de glymphatic actividad es crítica cuando se está estudiando su papel en la salud y la enfermedad.
Varios estudios han abordado su intercambio con el líquido intersticial (ISF) en el parénquima cerebral y dinámicas de la CFS. Sin embargo, los métodos por el cual se entregan etiquetadas moléculas son bastante invasivos, provocando daño de parénquima cerebral y cambios en la presión intracraneal (ICP) (ver comentario10). Algunos ejemplos son intraventriculares o inyecciones de intraparenchymal que implican craneotomía o perforación de las rebabas del agujero en el cráneo. Estos procedimientos han demostrado modificar el ICP, interrumpiendo así glymphatic función2. También, estos métodos invasivos inducen astrogliosis y aumentan el immunoreactivity de la AQP-4 en la zona de parénquima dañado del cerebro y sus alrededores11,12. Como astrocitos y AQP-4 son elementos clave del sistema glymphatic, el CMc es el método de elección para sus estudios. Las principales ventajas del CMc en comparación con procedimientos más invasivos son el mantenimiento de un parénquima cráneo y el cerebro intacto, evitando alteraciones de ICP y astrogliosis, respectivamente. Así, CMc junto con diferentes herramientas de imagen se abre una amplia gama de posibilidades para estudiar no sólo el sistema de glymphatic, sino también la dinámica y mecanismos de flujo de fluidos en la homeostasis, así como en modelos animales de enfermedades neurológicas.
El procedimiento de canulación (CMc) de cisterna magna permite acceso fácil y directo para el líquido cerebroespinal (CFS). Mediante la inyección de moléculas diferentes (por ejemplo, marcadores fluorescentes, agentes de contraste MRI) el experimentador puede seguir su movimiento dentro del compartimiento del CSF y evaluar la actividad del sistema glymphatic. El siguiente protocolo describe tanto la CMc aguda, inyecciones inmediatamente después de la cirugía y crónica implantación de la cánula, en el que el animal se recupera de la intervención quirúrgica para una inyección más adelante. La diferencia más importante entre la implantación aguda y crónica es que la implantación crónica permite el estudio de la actividad glymphatic en ratones despiertos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado un protocolo que describe un procedimiento detallado para la canulación de cisterna magna (CMc), que ofrece un método sencillo para entregar las moléculas marcadas en el compartimiento de la CSF. CMc permite la visualización posterior de la dinámica de la CSF, en vivo y ex vivo, con diferentes modalidades de imagen o histología.
Una de las principales ventajas de la técnica de CMc radica en su acceso directo al espacio subaracnoideo sin necesidad de ex…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Novo Nordisk e Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y Stroke, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. y S.H-R son los beneficiarios de una beca postdoctoral y una beca de doctorado de la Fundación Lundbeck, respectivamente.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
Referencias
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