Costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura
Summary
Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la costruzione di una libreria dei fagi-visualizzato anticorpo sintetico con diversità su misura. Gli anticorpi sintetici hanno vaste applicazioni dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica.
Abstract
Domanda per gli anticorpi monoclonali (mAbs) nella ricerca di base e la medicina è in aumento ogni anno. Tecnologia dell’ibridoma è stato il metodo dominante per lo sviluppo di mAb dal suo primo rapporto nel 1975. Come una tecnologia alternativa, metodi di visualizzazione dei fagi per sviluppo di mAb sono sempre più attraente poiché Humira, il primo anticorpo dei fagi-derivato e uno dei Best-Seller mAbs, è stato approvato per il trattamento clinico dell’artrite reumatoide nel 2002. Come un non-animale basato su tecnologia di sviluppo di mAb, esposizione dei fagi bypassa l’immunogenicità dell’antigene, umanizzazione e manutenzione degli animali che sono richiesti da ibridomi tradizionale tecnologia basato lo sviluppo di anticorpi. In questo protocollo, descriviamo un metodo per la costruzione di librerie Fab dei fagi-visualizzato sintetiche con le diversità del9-10 1010 ottenibili con un singolo elettroporazione. Questo protocollo si compone di: 1) preparazione delle cellule electro-competente ad alta efficienza; 2) estrazione di uracile-contenenti DNA single-stranded (dU-ssDNA); 3) metodo di Kunkel base mutagenesi oligonucleotide-diretta; 4) elettroporazione e calcolo della dimensione di biblioteca; 5) analisi della proteina A/L-based enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) per la piegatura e la valutazione della diversità funzionale; e 6) analisi di sequenza del DNA della diversità.
Introduction
anticorpi monoclonali hanno vaste applicazioni che vanno dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica. A partire dal 2016, mAbs più di 60 sono stati approvati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (USFDA) per il trattamento clinico delle malattie autoimmuni, il cancro e malattie infettive1,2.
Nel 1975, Kohler e Milstein segnalato una tecnica per la generazione continua di anticorpi di una singola specificità clonale da una fonte cellulare indicata come ‘ibridomi’ e questa tecnica è successivamente diventato una pietra miliare nella medicina e nell’industria3 ,4. Generazione di anticorpi monoclonali da questo metodo richiede vari passaggi tra cui la produzione dell’antigene, l’immunizzazione del mouse, estrazione dei linfociti B, fusione di cellule B con cellule di mieloma per formare cellule di ibridoma immortale, selezione clonale e per le applicazioni terapeutiche, umanizzazione è necessaria per evitare di anticorpo umano anti-topo (HAMA)4,5. Tuttavia, per questa tecnologia, gli antigeni incluse proteine altamente conservati tossine e agenti patogeni sono relativamente inefficaci nell’innescare la risposta immunitaria in vivo per mAb produzione5.
Nel 1978, Hutchison et al ha segnalato l’uso di un oligonucleotide di mutagenesi diretta di un residuo in un singolo filamento batteriofago virus6. Nel 1985, Smith ha riferito che frammenti di gene estraneo possono essere fuso nel telaio con del gene che codifica la proteina di cappotto dei fagi III e pertanto possono essere visualizzati sulla superficie dei fagi senza compromettere la sua infettività7. Questi lavori pionieristici gettato le basi per la successiva costruzione di librerie anticorpali dei fagi-visualizzati nel sistema immunitario, ingenuo, e sintetico forme con i formati del frammento variabile singola catena (scFv) e antigene-legante frammento (Fab) per terapeutico mAb sviluppo8,9. Dal punto di vista tecnico, lo sviluppo dei fagi dell’anticorpo basato su display offre un approccio complementare allo sviluppo basato su ibridoma mAb che possa aiutare ad per aggirare le limitazioni che possono rappresentare alcuni antigeni e processo di umanizzazione che anticorpi derivati ibridoma spesso richiedono5. A partire dal 2016, 6 phage display-derivato mAbs sono state approvate nel mercato compreso Humira, uno dei più riusciti mAbs utilizzato per il trattamento dell’artrite reumatoide, e molti dei fagi display-derivato dell’anticorpo candidati sono attualmente in varie fasi della clinica indagine10.
Per librerie anticorpali fagiche immunitario e ingenuo, la diversità di dideterminazione regioni (CDR) nella catena leggera e pesante è derivato dal repertorio immune naturale (vale a dire, dalle cellule di B). Al contrario, la diversità di CDRs in librerie anticorpali sintetico dei fagi è interamente artificiale. Approcci sintetici per la costruzione della libreria forniscono il controllo preciso sopra il disegno della diversità di sequenza e offrono opportunità per studi meccanicistici di struttura dell’anticorpo e funzionano11,12. Inoltre, il framework per le librerie sintetiche può essere ottimizzato prima costruzione della libreria per facilitare a valle, lo sviluppo industriale su larga scala11,12.
Nel 1985, Kunkel segnalati un approccio di mutagenesi basate su modelli single-stranded DNA (ssDNA) per introdurre le mutazioni sito-diretta in batteriofago M13 efficientemente13. Questo approccio è stato successivamente utilizzato ampiamente per costruzione delle librerie dei fagi-visualizzato. Oligonucleotidi di DNA sintetizzati chimicamente progettati per introdurre diversità nella Fab CDRs sono incorporati in un phagemid con un modello di spina dorsale dell’anticorpo. In questo processo, il phagemid è espressa come un uracile-contenente ssDNA (dU-ssDNA) e gli oligonucleotidi sono ricotto sul CDRs ed estesa per sintetizzare DNA a doppia elica (dsDNA) in presenza di DNA di T7 polimerasi e T4 DNA ligasi. Infine, generato ds-DNA può essere introdotto in Escherichia coli mediante elettroporazione.
Per elevata diversità, costruzione della libreria dei fagi-visualizzati, elettroporazione ad alta tensione di una miscela di due componenti delle cellule electro-competenti e covalenza dsDNA circolare chiusa (CCC-dsDNA) deve essere preparato con cura. Sidhu et per volta la preparazione di cellule competenti di electro e DNA da metodi tradizionali e notevolmente migliorato biblioteca diversità14.
In questo protocollo, descriviamo un metodo per la costruzione di librerie Fab dei fagi-visualizzato sintetiche con le diversità del9-10 1010 ottenibili con un singolo elettroporazione. La figura 1 Mostra una panoramica della libreria costruzione tra cui: 1) preparazione delle cellule electro-competente ad alta efficienza; 2) estrazione di dU-ssDNA; 3) metodo di Kunkel base mutagenesi oligonucleotide-diretta; 4) elettroporazione e calcolo della dimensione di biblioteca; 5) proteina A/L-based ELISA per la piegatura e la valutazione della diversità funzionale; e 6) analisi di sequenza del DNA della diversità. Tutti i reagenti, ceppi e attrezzature sono elencati nella tabella del materiale. La tabella 1 Mostra la configurazione di reagente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per costruire alta diversità, dei fagi-visualizzato Fab biblioteche, controllo di qualità sono necessari punti di controllo per monitorare le varie fasi del processo di costruzione, tra cui la competenza delle celle electro-competenti, qualità del modello dU-ssDNA, efficienza di CCC-dsDNA sintesi, titolo dopo elettroporazione, Fab pieghevole e diversità dell’amminoacido di CDRs mediante analisi di sequenza di cloni di Fab-fago.
Alta resa e purezza di dU-ssDNA è essenziale per tasso di alt…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori apprezzano Dr. Frederic Fellouse dal laboratorio Sidhu per osservazioni critiche sulla costruzione della libreria di Kunkel metodo basata sintetica dei fagi Fab. Gli autori apprezzano la signora Alevtina Pavlenco e gli altri membri dal laboratorio Sidhu per il prezioso aiuto di preparazione ad alta efficienza elettro-competenti le cellule e. coli e alta qualità dU-ssDNA. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No.: 81572698, 31771006) a DW e dall’Università di ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) al laboratorio di ingegneria dell’anticorpo.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Referencias
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