À l’aide de Terminal Transferase-mediated dUTP Nick fin-étiquetage (TUNEL) et la Caspase 3/7 Assays à mesure la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose

Amphibiens connaissent actuellement une les plus lourdes pertes de la biodiversité mondiale de n’importe quel taxons vertébrés¹. Des principales causes de ce déclin sont la chytridiomycose maladie fatale de la peau, causée par le champignon pathogène Batrachochytrium dendrobatidis, Bd². L’agent pathogène infecte superficiellement l’épiderme, ce qui peut conduire à la perturbation de la fonction de la peau entraînant une perte d’électrolytes sévère, un arrêt cardiaque et mort³. Divers mécanismes immunitaires hôte potentiel contre Bd sont actuellement à l’étude, tels que des peptides antimicrobiens^4,5,⁶de la flore bactérienne cutanée, récepteurs de cellules immunitaires^7,8, et lymphocytes activité^9,10. Cependant, peu d’études explore si épidermique l’apoptose et la mort cellulaire est un mécanisme immunitaire contre ce pathogène mortel.

Mort cellulaire par apoptose (mort cellulaire programmée) ou de la nécrose (mort non programmée), dans l’épiderme peut être une pathologie de l’infection de la Bd . Des recherches antérieures suggèrent que l’infection Bd peut induire l’apoptose parce que la perturbation des jonctions intracellulaires est observée lorsque des explants de peau sont exposés au surnageants in vitrode la zoospore¹¹. En outre, des modifications dégénératives épidermiques en Bd-grenouilles infectées sont observés à l’aide de la microscopie électronique^12,13. Des analyses transcriptomiques indiquent que les voies de l’apoptose sont surexprimés dans la peau infectée¹⁴, et gymnophiones splénocytes apoptose lorsqu’elles sont exposées à la Bd surnageants in vitro¹⁵. Malgré l’augmentation du volume des éléments de preuve suggérant que la Bd peut induire l’apoptose et hôte cellulaire mort in vitro, études in vivo qui explorent ou mesurer l’apoptosis manquent de mécanismes par le biais de la progression de l’infection. En outre, on ne sait pas si l’hôte utilise l’apoptose comme une stratégie défensive de système immunitaire à combattre l’infection de la Bd , ou si l’apoptose est une pathologie de la maladie.

Dans cette étude, nous avons cherché à détecter la mort des cellules épidermiques et l’apoptose dans des animaux infectés in vivo à l’aide de deux méthodes : l’analyse du protéine caspase 3/7 et terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) essai in situ avec. Comme chaque test détecte les différents aspects de la cellule mort¹⁶, ensemble ces méthodes fournissent une pleine compréhension des mécanismes impliqués dans la mort cellulaire et assurer une mesure précise de l’effet. L’analyse du caspase 3/7 quantifie l’activité d’effecteur caspases 3 et 7, qui permet la quantification des deux voies intrinsèque et extrinsèque de l’apoptose. En revanche, l’essai TUNEL détecte de fragmentation de l’ADN, qui est causée par des mécanismes de mort cellulaire dont l’apoptose, nécrose et pyroptosis¹⁷. Nous utilisons l’essai TUNEL pour étudier l’emplacement de la mort cellulaire dans l’épiderme des animaux cliniquement infectés et non infectés à l’aide de trois sections différentes de la peau : la face dorsale, la Virginie et la cuisse de corroboree de Pseudophryne. Cette méthode identifie le site anatomique de la mort cellulaire, mais aussi distinguer son emplacement dans les couches épidermiques spécifiques. Nous utilisons ensuite l’analyse du caspase 3/7 pour réaliser une quantification de série de temps de l’apoptose dans une infection de 8 semaines en Litoria verreauxii alpina. Nous prenons orteil pointe échantillons tous les quinze jours de ces mêmes animaux et sont en mesure de la charge de l’infection pathogène en corrélation avec l’activité de la caspase 3/7.