Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis

Amfibieën zijn momenteel een de grootste verlies van mondiale biodiversiteit van alle gewervelde taxa¹. Een belangrijke oorzaak van deze daling is de fatale huid ziekte chytridiomycosis, veroorzaakt door de schimmel pathogeen Batrachothrychium dendrobatidis, Bd². Het pathogene agens oppervlakkig infecteert de epidermis, die kan leiden tot verstoring van de functie van de huid leidt tot ernstige elektrolyt verlies, hartstilstand en overlijden³. Verschillende potentiële gastheer immuun mechanismen tegen Bd worden momenteel bestudeerd, zoals antimicrobiële peptiden^4,5, cutane bacteriële flora⁶, immuun cel receptoren^7,8, en lymfocyt activiteit^9,10. Echter onderzoeken weinig studies of epidermale apoptosis en cel dood een immuun mechanisme tegen dit dodelijke pathogenen is.

Celdood, apoptosis (geprogrammeerde celdood) of necrose (unprogrammed dood), in de epidermis mogelijk een pathologie van Bd infectie. Vorige onderzoek suggereert dat Bd infectie apoptosis veroorzaken kan, omdat verstoring van de intracellulaire kruispunten wordt waargenomen wanneer huid explantaten zijn blootgesteld aan Zoöspore supernatant in vitro¹¹. Bovendien, degeneratieve epidermale veranderingen in Bd-besmette kikkers zijn waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie^12,13. Transcriptomic analyses geven aan dat apoptosis trajecten upregulated in geïnfecteerde huid^{14 zijn}, en wormsalamanders splenocytes ondergaan apoptosis wanneer ze worden blootgesteld aan Bd supernatant in vitro¹⁵. Ondanks de groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat Bd kan veroorzaken cel apoptosis en de gastheer dood in vitro, in vivo studies die onderzoeken of het kwantificeren van apoptosis mechanismen door de progressie van de infectie ontbreken. Het is verder onbekend, gebruikt de host dit apoptosis als een defensieve immuun strategie ter bestrijding van Bd infectie of apoptosis is een pathologie van ziekte.

In deze studie, we gericht op het detecteren van epidermale celdood en apoptosis in besmette dieren in vivo met behulp van twee methoden: caspase-3/7 eiwit assay en terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ assay. Zoals elke bepaling verschillende aspecten van cel dood^{16 detecteert}, samen deze methoden geven een volledig inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij de dood van de cel en zorgen voor een nauwkeurige meting van het effect. Het caspase-3/7-assay kwantificeert de activiteit van effector caspases 3 en 7, waarmee kwantificering van zowel de intrinsieke en extrinsieke apoptosis trajecten. In tegenstelling, detecteert de TUNEL assay fragmentatie van DNA, die wordt veroorzaakt door cel dood mechanismen, met inbegrip van apoptosis, necrose en pyroptosis¹⁷. We gebruiken de TUNEL bepaling te onderzoeken van de locatie van de dood van de cel binnen de epidermis van zowel klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren met behulp van drie verschillende huid secties: het dorsum, de venter en de dij van Pseudophryne corroboree. Deze methode geeft de anatomische site van celdood, evenals de locatie binnen specifieke epidermale lagen onderscheid te maken. Vervolgens gebruiken we de caspase-3/7-bepaling uit te voeren een tijd serie kwantificering van apoptosis in een 8-weekse infectie in Litoria verreauxii alpina. We nemen teen tip monsters twee weken uit dezelfde dieren en zijn in staat om pathogenen infectie belasting correleren met caspase-3/7 activiteit.