Zebrafish जल्दी भ्रूण और ट्यूमर में सेलुलर विद्युत गतिविधि के दृश्य
Summary
यहां, हम एक सेलुलर बिजली वोल्टेज रिपोर्टर zebrafish लाइन बनाने की प्रक्रिया दिखाने के लिए भ्रूण विकास, आंदोलन, और vivo मेंमछली ट्यूमर कोशिकाओं कल्पना ।
Abstract
जैव विद्युत, अंतर्जात विद्युत सिग्नलिंग आयन चैनलों और पंपों सेल झिल्ली पर स्थित द्वारा मध्यस्थता, उत्तेजित न्यूरॉन और मांसपेशियों की कोशिकाओं और भ्रूण के रूप में कई अन्य जैविक प्रक्रियाओं, के संकेत प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है विकास की परिपाटी । हालांकि, हड्डीवाला embryogenesis में vivo इलेक्ट्रिकल गतिविधि मॉनिटरिंग में एक की जरूरत है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट वोल्टेज संकेतकों (GEVIs) के अग्रिम यह इस चुनौती के लिए एक समाधान प्रदान करने के लिए संभव बना दिया है । यहां, हम का वर्णन कैसे एक ट्रांसजेनिक वोल्टेज संकेतक zebrafish स्थापित वोल्टेज संकेतक का उपयोग कर बनाने के लिए, ASAP1 (कार्रवाई क्षमता 1 के त्वरित संवेदक), एक उदाहरण के रूप में । इस अध् ययन में Tol2 किट और एक सर्वव्यापी zebrafish प्रवर्तक, यूबीआई, चुना गया । हम भी गेटवे साइट विशेष क्लोनिंग, Tol2 transposon आधारित zebrafish transgenesis, और प्रारंभिक चरण मछली भ्रूण और मछली नियमित epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग ट्यूमर के लिए इमेजिंग प्रक्रिया की प्रक्रियाओं की व्याख्या । इस मछली लाइन का प्रयोग, हमने पाया कि zebrafish embryogenesis के दौरान सेलुलर बिजली वोल्टेज परिवर्तन कर रहे हैं, और मछली लार्वा आंदोलन । इसके अलावा, यह देखा गया कि कुछ zebrafish घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर में, ट्यूमर कोशिकाओं को आम तौर पर आसपास के सामान्य ऊतकों की तुलना में ध्रुवीकरण किया गया.
Introduction
अंतर्जात बिजली आयन चैनलों और सेल झिल्ली1पर स्थित पंपों द्वारा मध्यस्थता संकेतन विद्युतीकरण करने के लिए संदर्भित करता है । ईओण सेलुलर झिल्ली के पार एक्सचेंजों, और युग्मित विद्युत क्षमता और वर्तमान परिवर्तन, उत्तेजित ंयूरॉंस और मांसपेशियों की कोशिकाओं की प्रक्रिया संकेतन के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, जैव शक्ति और आयन ढाल ऊर्जा भंडारण, संश्लेषण, और metabolite परिवहन सहित अन्य महत्वपूर्ण जैविक कार्यों की एक किस्म है । इलेक्ट्रिक संकेतन भी भ्रूण पैटर्न गठन के एक नियामक के रूप में खोज की थी, शरीर कुल्हाड़ियों के रूप में, सेल चक्र, और सेल भेदभाव1। इस प्रकार, यह कई मानव जंमजात रोगों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि एमआईएस से परिणाम संकेतन के इस प्रकार के विनियमन । हालांकि पैच दबाना व्यापक रूप से एकल कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह अभी भी vivo मेंभ्रूण विकास के दौरान कई कोशिकाओं के एक साथ निगरानी के लिए आदर्श से दूर है । इसके अलावा, वोल्टेज संवेदनशील छोटे अणु भी उनके विशिष्टताओं, संवेदनशीलता, और विषाक्तता के कारण vivo अनुप्रयोगों में के लिए आदर्श नहीं हैं.
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट वोल्टेज संकेतकों (GEVIs) की एक किस्म के निर्माण के लिए इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए एक नया तंत्र प्रदान करता है, और आसान आवेदन के लिए भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, भले ही वे मूल रूप से थे तंत्रिका निगरानी के लिए इरादा कक्ष2,3। वर्तमान में उपलब्ध GEVIs में से एक कार्रवाई क्षमता 1 (ASAP1) के त्वरित संवेदक है4। यह वोल्टेज संवेदनशील फॉस्फेट और एक परिपत्र permuted हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक वोल्टेज सेंसिंग डोमेन के एक extracellular पाश से बना है । इसलिए, ASAP1 सेलुलर बिजली संभावित परिवर्तन (ध्रुवीकरण: चमकीले हरे रंग; ध्रुवीकरण: डार्क ग्रीन) के दृश्य की अनुमति देता है । ASAP1 में 2 ms है और बंद कैनेटीक्स है, और उपथ्रेशोल्ड संभावित परिवर्तन4को ट्रैक कर सकते हैं । इस प्रकार, इस आनुवंशिक उपकरण लाइव कोशिकाओं में वास्तविक समय में बिजली की निगरानी में प्रभावकारिता के एक नए स्तर के लिए अनुमति देता है । इस तरह के कैंसर के रूप में भ्रूण विकास और कई मानव रोगों में, बिजली की भूमिकाओं के आगे की समझ, अंतर्निहित तंत्र है, जो रोग के उपचार और रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण है पर नई रोशनी बहा देंगे ।
Zebrafish5,6कैंसर सहित विकासक जीवविज्ञान और मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल साबित किया गया है । वे मनुष्यों के साथ ७०% orthologous जीन का हिस्सा है, और वे इसी तरह हड्डीवाला जीव विज्ञान है7। Zebrafish अपेक्षाकृत आसान देखभाल, अंडे की एक बड़ी क्लच आकार, तंत्रीय आनुवंशिकी, आसान transgenesis, और पारदर्शी बाहरी भ्रूण विकास, जो उंहें vivo इमेजिंग5,6 में के लिए एक बेहतर प्रणाली बनाने प्रदान करते हैं । उत्परिवर्ती मछली लाइनों का एक बड़ा स्रोत पहले से ही मौजूद है और एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम के साथ, zebrafish वैज्ञानिक खोज के एक अपेक्षाकृत असीमित रेंज प्रदान करेगा ।
सेल की रीयल-टाइम इलेक्ट्रिकल गतिविधि में वीवो की जांच करने के लिए, हम zebrafish मॉडल प्रणाली और ASAP1 का लाभ उठाते हैं । इस पत्र में, हम का वर्णन कैसे zebrafish जीनोम में फ्लोरोसेंट वोल्टेज Tol2 transposon transgenesis का उपयोग कर ASAP1 शामिल करने के लिए, और भ्रूण विकास, मछली लार्वा आंदोलन के दौरान सेलुलर विद्युत गतिविधि कल्पना, और जीवित ट्यूमर में .
Protocol
Representative Results
Discussion
यद्यपि भ्रूण विकास और मानव रोग के दौरान सेलुलर और ऊतक स्तर की विद्युत गतिविधियों के एक लंबे समय से पहले खोज रहे थे, vivo में गतिशील विद्युत परिवर्तन और उनकी जैविक भूमिकाओं अभी भी मोटे तौर पर अज्ञात रहत?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रकाशन में बताया गया है कि इस शोध कार्य के अंतर्गत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज के पुरस्कार संख्या R35GM124913, इन्होने विश्वविद्यालय PI4D प्रोत्साहन कार्यक्रम, और PVM आंतरिक प्रतियोगी के द्वारा समर्थित बुनियादी अनुसंधान कोष कार्यक्रम । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि धन एजेंटों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । हम Tol2 के लिए कोइची Kawakami का निर्माण, ASAP1 के निर्माण के लिए माइकल लिन, और लियोनार्ड Zon के माध्यम से यूबीआई प्रवर्तक Addgene के निर्माण के लिए धंयवाद ।
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
Referencias
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
