Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços
Summary
Aqui nós apresentamos um método para um modelo humano em vitro de lesão de estiramento em um formato de 96 poços, numa escala de tempo relevante para o impacto do trauma. Isto inclui métodos para a fabricação de placas stretchable, quantificando o insulto mecânico, cultivo e ferindo células, imagem e análise de conteúdo elevado de quantificar a lesão.
Abstract
Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é um grande desafio clínico com alta taxa de morbidade e mortalidade. Apesar de décadas de pesquisa pré-clínica, desenvolveram-se sem terapias comprovadas para TBI. Este trabalho apresenta um método novo para pesquisa pré-clínica neurotrauma destinado a complementar os actuais modelos pré-clínicos. Ele introduz a fisiopatologia humana através do uso de neurônios de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas (hiPSCNs). Consegue o pulso de carregamento duração semelhante para as durações de carregamento da clínica fechada impacto cabeça lesão. Ele emprega um formato de 96 poços que facilita as experiências de alta taxa de transferência e faz o uso eficiente das células caras e reagentes de cultura. Membranas de silicone são primeiro tratadas para remover o polímero não polimerizado neurotóxico e então ligadas aos organismos comerciais placa de 96 poços para criar stretchable placas de 96 poços. Um dispositivo custom-built é usado para recuar alguns ou todos os fundos bem partir de baixo, induzindo equibiaxial esforços mecânicos que fere mecanicamente as células em cultura em poços. A relação entre a profundidade do recuo e esforços mecânicos é determinada empiricamente utilizando Videografia de alta velocidade de fundos bem durante o recuo. As células, incluindo hiPSCNs, podem ser cultivadas nestas membranas de silicone usando versões modificadas de protocolos de cultura de células convencional. Imagens microscópicas fluorescentes de culturas celulares são adquiridas e analisadas após a lesão de forma semi-automática para quantificar o nível de prejuízo em cada poço. O modelo apresentado é otimizado para hiPSCNs, mas poderia, em teoria, ser aplicado a outros tipos de células.
Introduction
TCE é das principais causas de mortalidade e morbidade nos Estados Unidos, causando cerca de 52.000 mortes e 275.000 hospitalizações a cada ano1. Foram realizados mais de 30 ensaios clínicos de terapêutica candidato para TBI sem um único sucesso2. Essa falha uniforme sugere que processos humanos específicos separam TBI humana a fisiopatologia observada em modelos de roedores pré-clínicos comumente usados.
O advento do hiPSCNs criou a oportunidade de estudar neurotrauma em um modelo humano em vitro . Com modelos baseados em hiPSCN de rastreio de drogas podem entregar resultados que são mais preditivos de sucesso clínico do que modelos empregando células de roedores. Além disso, hiPSCNs pode ser manipulado geneticamente para isolar e estudar o efeito de variantes genéticas humanas individuais na patologia3.
O método descrito neste manuscrito é projetado para trazer as vantagens únicas da doença baseada em hiPSCN modelagem de neurotrauma. Em vitro modelos de lesão de estiramento de neurotrauma são bem estabelecidos4,5,6 com células primárias de roedores e de linhas de células cancerosas humanas neural. A maioria destes modelos gera trecho pneumaticamente carregando uma membrana de silicone. Esta abordagem é eficaz em um único formato bem mas provou difícil de escala até um formato multi bem7. Como resultado, nunca houve uma tela de alta produtividade para agentes tratar estiramento neurônios feridos.
Neste modelo, a membrana se estende devido ao recuo de baixo com um rígida do indenter. Esta abordagem tem demonstrada repetidamente para gerar patologia clinicamente relevantes em vitro em sistemas bem simples8,9,10. Nossos trabalhos mais recentes tem mostrado que é facilmente escalas para um formato de 96 poços, mantendo durações de pulso da ordem de dezenas de milissegundos11, que é o tempo fechado de domínio de cabeça impacto eventos12,13.
Em resumo, as principais vantagens deste modelo de lesão em vitro são o formato de 96 poços, o uso de hiPSCNs e o domínio do tempo clinicamente relevantes do insulto.
Protocol
Representative Results
Discussion
A chave para a obtenção de uma consistente, fenótipo biofidelic neste modelo está aplicando um insulto mecânico biofidelic consistente. Este modelo pode gerar pulso durações tão curtas quanto 10 a 15 ms, que são semelhantes para as durações de pulso para impactos de cabeça humanas de acordo com experimentos cadavérico12,13. A consistência deste insulto varia de acordo com o alinhamento da placa com o bloco do indenter e lubrificação consistente dos indenters. Quando o bloco do indenter está bem alinhado, não há nenhuma tendência a deformação aplicado através de linhas ou colunas (Figura 2). Uma fina camada de lubrificante normalmente cria menos atrito do que uma camada espessa e viscosas graxas não são recomendadas porque falta o silicone e obstruir a passagem da luz durante a microscopia. A amplitude de deslocamento de fase real pode aquém substancialmente a amplitude de deslocamento prescrito quando muitos indenters são utilizados, e a amplitude de deslocamento de fase prescrita é grande (> 3 mm). No entanto, enquanto o deslocamento real é menor do que o prescrito deslocamento em grandes amplitudes, continua a ser repetível (Figura 2B). Portanto, amplitudes de deslocamentos grandes, real podem ser obtidos confiavelmente inserindo um valor prescrito excedam o valor desejado. Amplitude de deslocamento é importante só porque é um proxy facilmente gravado para a tensão de membrana de pico, que mede diretamente o insulto mecânico que induz a patologia. Portanto, o procedimento descrito para determinar a tensão de membrana de deslocamento de fase é crítico. Este processo deve ser repetido se qualquer grandes mudanças são feitas no sistema que afetam a interação entre a placa e os indenters, por exemplo, se for diferente indenters de diâmetro, do indenter diferentes materiais ou revestimentos ou diferentes tipos de silicone placa de fundo são usados. O processo de realinhamento do bloco do indenter e determinar a posição de zero deve ser repetido no início de cada experimento. Um diagrama esquemático do dispositivo alongamento é mostrado na Figura 1. Modelos CAD necessários para reproduzir o dispositivo são fornecidos como materiais complementares: ‘ dispositivo de lesão – conjunto completo – 3D genéricos. PASSO ‘; a conta associada de materiais fornecidos comosuplementares tabela 1: Custom construiu dispositivos – BOM.xlsx. Consulte também complementar tabela 2 96 bem placa _loader – Pinout fiação Diagram.xlsx, que descreve as conexões cabos que conectam os vários componentes dos sistemas. ‘Interconnector_circuit_board.dip’ descreve uma placa de circuito que interliga os cabos.
Se o dispositivo está desativado com o palco no meio do seu curso, o estágio vai passar depois que a energia é cortada, porque é com mola. Quando a energia for restaurada, o circuito de retroalimentação irá detectar uma diferença grande entre a última posição prescrita e a posição real. Isso fará com que o estágio mover-se de repente para a posição que estava quando o dispositivo foi desativado. Este movimento repentino pode causar erros na saída do codificador, assim que cuidado deve ser tomado para desactivar o dispositivo somente quando ele é em sua energizados posição de descanso no topo da sua viagem.
A braçadeira de fabricação é projetada para reunir a placa inferior de silicone e corpo de uma forma que permite a ligação ideal. Para este efeito, existem três características principais no projeto apresentado no arquivo suplementar ‘ imprensa morrer – 3D genéricos. PASSO ‘. Primeiro, o suporte de corpo de chapa braçadeira é paralela ao fundo do silicone. Não se este é corretamente construído, exigirá nenhum ajuste após a instalação inicial. Em segundo lugar, a camada de espuma de borracha no grampo fornece uma pequena quantidade de conformidade sob a placa, como um sistema completamente rígido teoricamente iria experimentar um súbito aumento de zero força de aperto para infinita força de aperto quando o grampo foi fechado. A posição da trave e parafuso de fixação do grampo são ajustáveis para que a distância entre os dois lados da pinça pode ser afinada.
Todos os esforços devem fornecer um fundo brilhante, branco atrás do ponto na parte inferior bem durante experimentos de caracterização de estirpe. Melhor o contraste nestas imagens, mais fácil será para automatizar o processo de medir a altura e largura do ponto, que pode se tornar entediante para um operador humano analisando um grande experimento. Videografia de alta velocidade, de fundo de um poço em uma placa de 96 poços apresenta desafios porque as paredes do poço tendem a projetar sombras. O uso de uma cúpula de luz ou luz axial difusa que pode iluminar-se ao longo da linha de visão da câmera sem obscurecer a imagem elimina sombras ou reflexos especulares que surgem com uma fonte de luz convencional. A mais brilhante fonte de luz disponível deve ser usada porque a iluminação brilhante permite que as imagens a serem adquiridos com um tempo de exposição curto. Tempos de exposição curtos minimizam de motion blur. Atualizando a luz emitindo-se diodos (LEDs) na luz difusa axial permite tempos de exposição mais curtos durante a aquisição de vídeo de alta velocidade. Os LEDs podem ser atualizados através da abertura a luz difusa e axial, removendo o estoque de LEDs, montagem 4 de alta potência LED matrizes para o painel traseiro usando LEDs titulares, conectando-os a uma fonte de alimentação de corrente constante e voltar a montar a luz difusa axial (ver tabela de de Materiais para os números de catálogo). A desvantagem de atualizar os LEDs é que os LEDs passivamente resfriados não podem ser mantidos por mais de alguns segundos devido ao risco de sobreaquecimento. Portanto, uma luz diferente é necessária para o alinhamento do ajustamento pós-bloco e câmera.
O método apresentado de quantificar a tensão de membrana, medindo a dilatação de um ponto carimbado para a membrana é relativamente primitiva, mas ele pode escalar até vários poços de forma robusta. O campo de tensão através da parte inferior bem pode ser caracterizado em mais detalhes usando a correlação da imagem digital. Esta técnica envolve a pulverização um padrão salpicado na base do poço e depois de imagens em alta velocidade durante a deformação. Software comercial, então, pode ser usado para quantificar a tensão em cada ponto da imagem seguindo a evolução do padrão salpicado.
Este protocolo produz um fenótipo de lesão multi-facetada, clinicamente relevantes, estiramento em hiPSCNs. Morte celular e degeneração do axônio axônio perolização são tudo bem documentadas sequelas de TCE em humanos e animais modelos15. A chave para o sucesso deste modelo é estabelecer e manter culturas saudáveis. De um modo geral, um protocolo de cultura celular desenvolvido com placas rígidas convencionais é um ponto de partida útil para cultura de placa stretchable. No entanto, sempre deve ser considerada a possibilidade de que as células em questão podem responder diferentemente em silicone. Isto é particularmente verdadeiro de hiPSCNs, que são muito sensíveis às condições de cultura. Alguns exemplos de otimização de concentração de densidade e laminina células são fornecidos na seção de Resultados de representante (Figura 3, Figura 4). Ativação do silicone com tratamento de plasma é vital. Silicone é hidrofóbica e ́; em seu estado natural, não vinculará a laminina ou outras moléculas usadas para promover a fixação da célula. Tratamento de plasma processa a superfície hidrofílica e expõe os grupos reativos. Estas alterações permitem que moléculas de adesão ligar para o silicone e promover a fixação da célula. É importante notar que o efeito do tratamento de plasma dissipa-se em poucos minutos a menos que a superfície está submersa no líquido, e então os procedimentos que envolvem a secagem da superfície ativada devem ser realizados logo que possível. Uma maneira simples de verificar se o efeito do tratamento de plasma desgastou fora é colocar uma gota de água sobre a superfície. Em silicone não tratado, a gota será talão acima, Considerando que na plasma Tratado silicone, vai se espalhar para fora. Com o hiPSCNs que usamos (ver Tabela de materiais), o fabricante recomenda adicionando a laminina com a suspensão de células em vez de pre-revestimento. Este protocolo incorporou essa abordagem com êxito. Enquanto a segmentação pode, em teoria, ser realizada com software open source ou linguagens de programação de uso geral, um alto grau de proficiência com essas ferramentas é necessário para obter bons resultados. Neuritos são frequentemente difíceis de distinguir do sinal de fundo porque eles são tão esbelto. Portanto, recomendamos o uso de ferramentas de software comerciais distribuídos por empresas de elevado conteúdo de microscopia com módulos dedicados para segmentação e quantificação dos neurônios, se eles estiverem disponíveis. Mesmo com o software comercial, é sábio exportar imagens da segmentação para verificar visualmente a exactidão.
Existem algumas limitações associadas trabalhando em placas stretchable comparadas ao trabalhar com placas convencionais, rígidas. Stretchable placas podem ser fotografadas como normal com objectivos de ar. No entanto, a imagem latente com objectivos de imersão é muito difícil. Lente de petróleo pode danificar o silicone. Além disso, o objetivo exerce pressão sobre a membrana de silicone, enquanto se move para cima. Esta pressão desloca a membrana verticalmente, tornando difícil de levar a amostra em foco. As membranas de silicone usadas atualmente na fabricação das placas são aproximadamente 250 µm de espessura. Esta espessura excede a distância focal de muitos de alta potência, objectivos de imersão. Deve ter especial cuidado para colocar as membranas perfeitamente plana antes de fixar para alcançar o nivelamento necessário para microscopia. Sistemas de focagem automática de desvios podem compensar no nivelamento da placa terminada em certa medida. Versões futuras do protocolo podem pre-tensão da membrana antes que é ligado a parte superior da placa para garantir a planicidade. O procedimento sem cola para colagem da membrana do silicone para a placa top14 é considerado uma importante força do protocolo atual. Elimina o risco de neurotoxicidade do adesivo, bem como quaisquer desvios no nivelamento devido à não-uniforme de espessura da camada de adesivo.
Eletrodo multi matrizes são comumente usados em experimentos com hiPSCNs para avaliar a sua maturidade e funcionalidade. Infelizmente, esses sistemas são incompatíveis com este modelo porque o substrato de cultura de célula é rígido. É possível criar uma matriz de multi eletrodo stretchable, embora isto até agora só foi demonstrado em um único bem formato16,17. Observe que indenters podem ser removidos individualmente do bloco do indenter para que alguns poços não são recuados e podem servir como Souza. Remover o indenter impede recuo, mas não elimina completamente carregamento mecânico, desde que não há movimento ainda por inércia do fluido nos poços, enquanto o palco está se movendo. Vale a pena comparar esses poços poços em placas que foram nunca sujeitos a movimento de palco para medir qualquer influência patológica do movimento do fluido. Além disso, a matriz de indenters no bloco deve ser bisymmetric (simétrica da frente para trás e para os lados). Esta precaução garante que a placa é uniformemente carregada durante o recuo, para que o palco não inclinar para o lado e causar as barras vincular em seus rolamentos.
Um dos principais desafios para inovação terapêutica em neurotrauma é a complexidade e heterogeneidade da condição. Trauma aplica stress multimodal para cada tipo de célula no sistema nervoso central simultaneamente. Os neurônios foram confiantemente gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) e estão amplamente disponíveis de fornecedores comerciais. Inovação é avançar rapidamente neste campo, e outros tipos de células neurais como astrócitos18 e microglia19 também estão sendo derivados de hiPSCs. Logo é possível isolar as célula autónomos respostas de cada um desses tipos de célula para trauma em vitro e em seguida co-cultura diferentes tipos de células para entender como eles se comunicam após trauma. Desta forma, em última análise, pode ser possível recriar o desafio clínico do fundo acima de completamente compreendê-lo em um sistema humano. Esta abordagem difere da abordagem convencional, baseando-se em modelos de roedores e tem o potencial de gerar novos insights que levam para as terapias de primeiras para esta condição comum, devastador e intratável.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é financiado em parte por uma concessão do National Institutes of Health (R21NS098129). Nós gostaríamos de reconhecer a excelente assistência técnica de SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng e Feng Yuan Bu, que projetou e construiu uma estrutura para suportar as luzes usadas durante experimentos de imagem de alta velocidade descritos neste manuscrito .
Materials
| .010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
| Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
| Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
| Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
| High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
| LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
| LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
| FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
| 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
| servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
| Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
| cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
| digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
| data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International | ||
Referencias
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