Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen
Summary
Burada bir 96-iyi biçimde travma etkisi ilgili bir zaman ölçeği üzerindeki insan vitro manken streç yaralanma için bir yöntem mevcut. Bu mekanik hakaret, kültür ve hücreleri yaralanmasına, görüntü ve yaralanma ölçmek için yüksek içerik analizi miktarının gerilebilir tabak imalatı için yöntemler içerir.
Abstract
Travmatik beyin hasarı (TBY) Yüksek morbidite ve mortalite ile büyük bir klinik sorun olduğunu. Önceden klinik araştırmalar yılların rağmen hiçbir kanıtlanmış tedaviler Tby için geliştirilmiştir. Bu kağıt varolan önceden klinik modelleri tamamlamak amacıyla önceden klinik neurotrauma araştırma için yeni bir yöntem sunuyor. İnsan patofizyolojisi İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlar (hiPSCNs) aracılığıyla sunar. Yükleme darbe elde süre yükleme süreleri klinik için benzer kapalı kafa etkisi yaralanma. Yüksek işlem hacmi deneyler kolaylaştırır ve pahalı hücreleri ve kültür Kimyasalları verimli kullanır bir 96-şey biçimi kullanır. Silikon membran Nörotoksik iyileşmemiş polimer kaldırmak için ilk tedavi ve gerilebilir 96-şey tabak oluşturmak için ticari 96-şey plaka vücuduna bağlanmış. Özel olarak oluşturulmuş bir cihaz mekanik hücre kültür Wells yaralı equibiaxial mekanik zorlanma inducing bazılarını veya tümünü altında iyi dipleri girinti oluşturmak için kullanılır. Girinti derinlik ve mekanik zorlanma arasındaki ilişkiyi ampirik olarak yüksek hızlı videografisi iyi dipleri, girinti sırasında kullanılarak belirlenir. Hücreleri, hiPSCNs, dahil olmak üzere geleneksel hücre kültür protokolleri değiştirilmiş sürümlerini kullanarak bu silikon membran kültürlü. Hücre kültürleri floresan mikroskobik görüntülerini elde ve yaralanma yaralanma her iyi düzeyini ölçmek için yarı otomatik bir moda sonra analiz. Sunulan model hiPSCNs için en iyi duruma getirilmiş ancak teorik olarak diğer hücre tipleri için uygulanabilir.
Introduction
Tby civarında 52,000 ölümler ve 275,000 olabilecek her yıl1neden bir önemli mortalite ve morbidite Amerika Birleşik Devletleri’nde nedenidir. 30’dan fazla klinik aday therapeutics Tby için tek başarı2olmadan yapılmıştır. Bu üniforma başarısızlık insan özel işlemler sık kullanılan önceden klinik kemirgen modellerinde gözlenen patofizyolojisi insan Tby ayrı öneriyor.
HiPSCNs gelişiyle neurotrauma bir insan vitro modelde eğitim için bir fırsat yarattı. HiPSCN tabanlı modeller ile eleme uyuşturucu kemirgen hücreleri istihdam modelleri klinik başarısı daha akıllı sonuçlar. Ayrıca, hiPSCNs genetik olarak ayırmak ve bireysel insan genetik varyantların etkisi patoloji3çalışma için manipüle edilebilir.
Bu el yazması açıklanan yöntemi hiPSCN tabanlı hastalığı neurotrauma için modelleme benzersiz avantajları getirmek için tasarlanmıştır. Vitro streç yaralanma neurotrauma iyi kurulmuş4,5,6 birincil kemirgen hücreleri ve insan sinir kanser hücre hatları ile modellerdir. Bu modellerin çoğu streç pnömatik silikon membran yükleyerek oluşturmak. Bu yaklaşım tek bir iyi biçimde etkilidir ama çok iyi biçim7toplanmakta zor kanıtlamıştır. Sonuç olarak, bir yüksek üretilen iş ekran streç yaralı nöronlar tedavisi aracıları için olmamıştı.
Bu modelde, membran altında sert bir uç ile girinti nedeniyle uzanır. Bu yaklaşımı art arda klinik patoloji vitro tek iyi sistemleri8,9,10‘ oluşturmak gösterilmiştir. Son çalışmalarımız bu kolayca bir 96-şey formatını hangi etki alanının baş etkisi olaylar12,13kapalı zamanı darbe süreleri milisaniye11, onlarca sırasını koruyarak ölçekler olduğunu göstermiştir.
Özetle, 96-şey biçimi, hiPSCNs kullanımı ve klinik saat alan hakaret bu vitro yaralanma modeli anahtar avantajları bulunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tutarlı bir elde etmek için anahtar, bu modelde biofidelic fenotip tutarlı biofidelic mekanik hakaret uyguluyor. Bu modeli darbe süreleri kısa 10-15 ms, kadavra deneyler12,13göre insan kafa etkileri için darbe süreleri benzer olarak oluşturabilir. Bu hakaret tutarlılığını uç blok ile plaka hizalamasını ve tutarlı yağlama indenters bağlıdır. Uç blok de hizalandığında var. hiçbir eğilim uygulanan gerilim satırlar veya sütunlar (şekil 2C) arasında İnce bir tabaka yağ genellikle daha az sürtünme daha kalın bir tabaka oluşturur ve çünkü onlar silikon faul ve ışık geçirilmesi sırasında mikroskobu engel viskoz Gresler tavsiye edilmez. Gerçek sahne deplasman genlik önemli ölçüde zaman birçok indenters kullanılır ve öngörülen sahne deplasman genlik büyük (> 3 mm) reçete deplasman genlik kısa düşebilir. Ancak, gerçek öteleme büyük genlikleri de öngörülen deplasman daha az olmakla birlikte, yinelenebilir (şekil 2B) kalır. Bu nedenle, büyük, gerçek talebiyle genlikleri güvenilir bir şekilde istediğiniz değeri aşan öngörülen bir değer girerek elde edilebilir. Sadece doğrudan patoloji indükler mekanik hakaret ölçer tepe membran zorlanma için kolayca kaydedilen bir proxy olduğu için deplasman genlik önemli değil. Bu nedenle, membran zorlanma sahne deplasman dan belirlemek için açıklanan yordamı önemlidir. Bu işlem herhangi bir önemli değişiklik plaka ve indenters farklı olması durumunda örneğin arasındaki etkileşimi etkileyen sistem için yapılır yinelenmelidir çapı indenters farklı uç malzemede veya kaplama veya silikon farklı türleri kaynatıp plaka kullanılır. Uç blok yeniden ve sıfır konumu belirleme işlemi her denemenin başlangıcında yinelenmelidir. Germe cihazın bir şematik Resim 1‘ de gösterilen. Aygıtı yeniden oluşturmak için gerekli CAD modellerini tamamlayıcı malzemesi olarak sağlanır: ‘ yaralanma aygıt – tam derleme – genel 3D. ADIM ‘; ilişkili ürün reçetesi sağlanan olarakek tablo 1: özel cihazlar – BOM.xlsx inşa. Ayrıca ek tablo 2 96 de plaka _loader – Bağlantı Diagram.xlsx kablolamasistemleri çeşitli bileşenleri bağlama kablo bağlantıları açıklar, bkz. ‘Interconnector_circuit_board.dip’ ara bağlantı kabloları bir devre kartı açıklar.
Devre dışı bırakıldı-sahnenin ortasına doğru seyahat ile yaylı olduğundan güç kesilir sonra sahne alanı taşır. Güç sağlandığında, geri besleme döngüsü son bilinen öngörülen pozisyonu ve gerçek pozisyon arasında büyük bir fark algılar. Bu aygıt devre dışı zaman oldu konumuna aniden taşımak için sahne neden olur. Ne zaman sadece bu onun beslemesiz pozisyon onun seyahat üstündeki dinleniyor aygıtı devre dışı bırakmak için dikkat edilmelidir böylece bu ani hareket kodlayıcı, çıktıda hatalara neden olabilir.
İmalat kelepçe plaka alt vücut ve silikon birlikte en iyi bağ sağlar bir şekilde getirmek için tasarlanmıştır. Bu amaçla, orada ek dosyanın içinde sunulan tasarımında üç temel özellikleri nelerdir “basın Die – Genel 3D. ADIM ‘. İlk olarak, kelepçe plaka vücut sahibi silikon yukarıdan aşağıya doğru paralel değildir. Bu düzgün oluşturulduysa, herhangi bir düzeltme sonra ilk kurulum gerektirir. İkincisi, kelepçe kapatıldığında tamamen katı bir sistem teorik olarak sonsuz sıkma gücü sıfır sıkma gücü bir ani artış deneyim olarak kelepçe Köpük kauçuk katman uyumluluğu altında plaka, az miktarda sağlar. Kol demiri konumunu ve kelepçe set vida ayarlanabilir böylece kelepçe iki kenarı arasındaki uzaklığı ince ayar olabilir.
Her türlü çabayı nokta arkasında parlak, beyaz bir arka plan üzerinde iyi alt soy karakterizasyonu deneyler sırasında sağlamak için yapılmalıdır. Daha iyi kontrast bu Albümdeki kolay yükseklik ve genişlik büyük bir deneme analiz insan bir operatör için sıkıcı olabilir nokta ölçme işlemini otomatikleştirmek için olur. Çünkü duvarlar iyi gölge eğilimi bir 96-şey plaka bir kuyunun yüksek hızlı videografisi sorunlar sunar. Bir kubbe ışık veya kameranın görüş hattı görüntü engel olmadan aydınlatmak diffüz Aksiyel ışık gölgeler veya geleneksel bir ışık kaynağı ile ortaya çıkacak aynasal yansımaları ortadan kaldırır. Parlak aydınlatma görüntüleri ile kısa maruz kalma süresi elde edilebilir için izin verdiği için kullanılabilir en parlak ışık kaynağı kullanılmalıdır. Kısa pozlama süreleri Hareket Bulanıklığı en aza indirmek. Diffüz Aksiyel ışık ışık yayan diyotlar (LED’ler) yükseltme yüksek hızlı video alma sırasında kısa maruz kalma süreleri sağlar. LED’ler diffüz Aksiyel ışık açarak stok LED kaldırma yükseltilebilir, 4 yüksek güç montaj LED LED sahipleri kullanarak, onlara sabit bir geçerli elektrik şebekesine bağlanması ve diffüz Aksiyel ışık (bakınız tablo ile yeniden toplama arka bölmesine diziler Malzemeler Katalog numaraları için). LED’ler yükseltme pasif soğutmalı LED’ler aşırı ısınma riski nedeniyle bir kaç saniye için tutulması cant dezavantajdır. Bu nedenle, farklı bir ışık sonrası blok ve kamera düzeltmesi hizalama için gereklidir.
Membran üzerinde damgalı bir nokta dilatasyon ölçerek membran yük miktarının sunulan yöntem nispeten ham, ama o sağlam bir şekilde birden fazla wells için büyütmek. İyi alt soy tarlada dijital görüntü korelasyon kullanarak daha ayrıntılı olarak karakterize edilebilir. Benekli bir desen üssün kuyunun üzerine püskürtme ve bunda Imaging bu tekniği içerir deformasyon sırasında yüksek hızlı. Ticari yazılım daha sonra benekli desen evrimi takip ederek zorlanma görüntüdeki her noktasında ölçmek için kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı bir çok yönlü, klinik, streç yaralanma fenotip hiPSCNs içinde üretir. Hücre ölümü, neurite dejenerasyon ve neurite boncuk Tby iyi belgelenmiş sekel insanlarda ve hayvan15modelleri. Bu modelde başarının anahtarı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan sağlıklı kültürler. Genel olarak, geleneksel sert plakalar ile geliştirilen bir hücre kültür gerilebilir plaka kültür için değerli bir başlangıç noktası protokoldür. Ancak, söz konusu hücre silikon üzerinde farklı şekilde yanıt verebilir olasılığı her zaman dikkate alınmalıdır. Bu özellikle kültür koşulları için çok hassas hiPSCNs doğrudur. Bazı örnekler hücre yoğunluğu ve laminin toplama en iyi duruma getirme (şekil 3, şekil 4) Temsilcisi sonuçları bölümünde sağlanır. Silikon plazma tedavisi ile aktivasyonu hayati önem taşımaktadır. Silikon hidrofobik ve tepkisizdir. doğal haliyle bu laminin veya hücre eki tanıtmak için kullanılan diğer molekülleri bağlamak değil. Plazma tedavi yüzey hidrofilik işler ve reaktif grupları gösterir. Bu değişiklikler için silikon bağlamak ve hücre eki tanıtmak adezyon molekülleri izin. Plazma tedavi etkisi yüzey sıvı içinde sular altında sürece ve aktif yüzey kurutma ilgili yordamlar kısa zamanda gerçekleştirilmesi gereken bu yüzden birkaç dakika içinde kalır unutmamak gerekir. Plazma tedavisinin etkisi yıpranmış Eğer kontrol etmek için basit bir yol yüzeyinde bir damlacık su yerleştirmektir. Bu yayar tedavi plazma silikon üzerinde ise tedavi edilmezse silikon üzerinde yukarı damlacığı boncuk. Biz kullanılan hiPSCNs ile (bkz. Tablo reçetesi) Üretici önerir laminin öncesi kaplama yerine hücre süspansiyon ile ekleme. Bu iletişim kuralı bu yaklaşım başarılı bir şekilde birleştirmiştir. Segmentasyon teorik olarak, açık kaynak yazılım veya genel amaçlı programlama dilleri ile gerçekleştirilebilir iken bu araçları yeterlilik yüksek derecede iyi sonuçlar elde etmek için gereklidir. Neurites sık sık çok ince oldukları için arka plan sinyalini ayırt etmek zordur. Bu nedenle, varsa özel ölçü birimi için segmentasyon ve nöronların, miktar ile yüksek içerik mikroskobu şirketler tarafından dağıtılmış ticari yazılım araçları kullanmanızı tavsiye ederiz. Hatta ticari yazılım ile görsel olarak doğruluğunu doğrulamak için ayrılmasını görüntüleri dışa aktarmak akıllıca olacaktır.
Gerilebilir plakaları ile geleneksel, sert plakalar çalışmaya göre çalışma ile ilgili bazı sınırlamalar vardır. Gerilebilir plakaları hava hedefleri ile normal olarak yansıması. Ancak, görüntüleme daldırma hedefleri ile çok zordur. Objektif petrol silikon zarar verebilir. Buna ek olarak, yukarı doğru hareket ederken amacı silikon membran üzerinde basınç uygular. Bu basınç membran dikey olarak, örnek odak haline getirmek üzere displaces. Şu anda plakaları imalatı kullanılan silikon membran yaklaşık 250 µm kalınlığında vardır. Bu kalınlık çok yüksek güç, daldırma hedefleri odak mesafesini aşıyor. Membranlar mükemmel düz mikroskopi için gerekli düzlemsellik ulaşmak için sıkma önce koymak için özel bakım alınması gerekir. Otofokus sistemleri için sapmaların bir dereceye kadar bitmiş plaka düzlemsellik telafi edebilirsiniz. Düzlük sağlamak için levhadanoluşan üst gümrüklü önce Protokolü’nün gelecek sürümlerinde önceden membran gerginlik. Silikon membran plaka üst14 bağlar yapıştırıcı-Alerjik yordamı geçerli Protokolü’nün önemli bir güç olarak kabul edilir. Düzlük üniform olmayan yapışkan tabaka kalınlığı nedeniyle içinde nörotoksisite yapıştırıcı yanı sıra herhangi bir sapma riskini ortadan kaldırır.
Çoklu elektrot dizilerin onların olgunluk ve işlevselliğini değerlendirmek için sık hiPSCNs ile deneyler kullanılır. Hücre kültür substrat sert olduğu için ne yazık ki, bu sistemler bu model ile uyumlu değildir. Gerilebilir çoklu elektrot dizi oluşturur, bu defa yalnızca tek bir de gösterilmiştir, ancak16,17format mümkündür. Böylece bazı kuyular değil girintilidir ve Şems hizmet verebilir indenters tek tek uç bloğundan kaldırılabilmesi için unutmayın. Uç kaldırma girinti engeller, ancak tamamen beri hala atalet hareket sıvı Wells sahne hareket ediyor ise mekanik yükleme ortadan kaldırmaz. Bu sıvı hareket herhangi bir patolojik etkisini ölçmek için asla sahne hareket tabi vardı plakalar wells için Bu kuyu karşılaştırılarak değer. Ayrıca, blok indenters dizi bisymmetric (önden arkaya simetrik ve yan yana) olmalıdır. Bu önlem, böylece sahne yana doğru eğimli değil ve kendi yatakları bağlamak çubuklar neden plaka eşit girinti sırasında yüklenir sağlar.
Neurotrauma tedavi edici yenilik için birincil zorluklardan biri karmaşıklığı ve heterojen durumu var. Travma Multi-Modal stres her hücre tipi santral sinir sistemi içinde aynı anda uygulanır. Nöronlar güvenilir İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hiPSCs) oluşturulan ve şimdi ticari satıcıları tarafından yaygın olarak mevcuttur. Yenilik bu alanda hızlı bir şekilde ilerliyor, ve diğer sinir hücre tipleri gibi astrocytes18 ve microglia19 da hiPSCs türetilmiştir. Yakında hücre özerk yanıt travma vitro ve sonra ortak kültür farklı hücre tipleri travmadan sonra nasıl iletişim kuruyorlar anlamak için bu hücre türlerinin her biri izole etmek mümkün olabilir. Bu şekilde, sonuçta iyice bir insan sistemi anlamaya kadar alt klinik meydan yeniden oluşturmak mümkün olabilir. Bu yaklaşım kemirgen modellerde güvenerek geleneksel yaklaşım ayrıdır ve bu ortak, yıkıcı ve zorlu durum için ilk tedavi neden roman anlayışı oluşturmak için bir potansiyele sahiptir.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen bir hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21NS098129) tarafından desteklenmektedir. SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng ve tasarlayan ve bu el yazması açıklanan yüksek hızlı görüntüleme deneyler sırasında kullanılan ışıklar desteklemek için bir yapı inşa Feng Yuan Bu mükemmel teknik yardım kabul etmek istiyoruz .
Materials
| .010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
| Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
| Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
| Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
| High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
| LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
| LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
| FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
| 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
| servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
| Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
| cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
| digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
| data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International | ||
Referencias
- Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. . Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).
- Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).
- Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).
- Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).
- Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).
- Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).
- Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).
- Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).
- Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).
- Kang, W. H., Morrison, B. Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).
- Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
- Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
- Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
- Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).
- Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).
- Yu, Z., Morrison, B. Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).
- Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
