PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits

1. désintoxication de silicone Couper les 254 µm épais, membranes de silicone de 30,48 cm x 30,48 cm en rectangles de 7,5 cm x 11 cm à l’aide d’une lame de rasoir et un modèle d’acrylique. 10 membranes rectangulaires sont possibles avec chaque feuille. Enregistrez le document qui vient avec le silicone. Placer la membrane dans un baquet d’eau désionisée de (DI) avec du savon de la verrerie. Un à la fois, frottez les membranes vigoureusement avec des doigts gantés pendant au moins 20 s ou jusqu’à ce que mousser. Rincer les membranes DI l’eau courante jusqu’à ce que le savon moins est visiblement enlevé. Poser les membranes sur le papier (à partir de leur emballage) et autoclave selon un cycle de gravité. Faire tremper chaque membrane silicone dans 250 mL d’éthanol à 70 % par la membrane dans un agitateur orbital à 60 tr/min pendant 24 h. utiliser un conteneur fabriqué dans un matériau qui ne réagit pas avec de l’éthanol, comme le polypropylène. Si plus d’une membrane est placée dans un bac unique, ou si les membranes collent au fond du bac, séparer les membranes de leur environnement avec pointes de pipette en plastique et Pipeter grilles de pointe. Transférer les membranes de silicone avec des mains gantées dans 250 mL d’eau DI par membrane et faire tremper dans l’agitateur orbital pendant 48 h à 60 t/mn. Poser les membranes sur le papier et les place dans un four de verrerie de 93 ° C pendant 4 h. Stocker les membranes sur le papier, dans un endroit propre et sec, recouvert d’une autre feuille de papier pour les protéger de la poussière. 2. plaque Fabrication Plasma traiter un dessus de la plaque à 96 puits avec un plasma W 200 nettoyant (voir Table des matières) pour 60 s à puissance maximale, il mise bas-côté-vers le haut à l’intérieur du plasma cleaner. Vous recherchez une lueur pourpre visible à travers la fenêtre de la chambre, ce qui indique qu’un plasma efficace a formé. Cette technique de collage est une adaptation d’Allan et al. 14 Dans les 60 s, placez la plaque dans 200 mL de 1,5 % (3-Aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) dans l’eau distillée pendant 20 min, fond incliné. Cette solution est instable : Préparez-le ne dépasse pas 60 s avant d’introduire la plaque.ATTENTION : Les travaux avec APTES sous une hotte. Plasma traiter une membrane de silicone extraite dans le plasma nettoyant pour 60 s à puissance maximale. Le temps du traitement plasma telle qu’elle finit pas plus de 5 min avant la fin de la période de 20 min à l’étape 2.2. Utiliser les pinces pour positionner la membrane plasmique traité sur le dessus un rectangle de papier parchemin 7,5 x 11 cm2 . Aligner un 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm en aluminium dalle sur la partie inférieure de la pince de fabrication de plaque. Aligner le papier siliconé de membrane et le parchemin sur la dalle en aluminium avec une pincette.NOTE : Les fichiers de conception assistée par ordinateur (CAO) pour cet appareil sont fournis dans les matériaux supplémentaires comme un fichier de code supplémentaire ‘ Die Presse – 3D génériques. ÉTAPE ‘. La nomenclature associée est fournie en supplémentaire tableau 1 : Custom construit des dispositifs – BOM.xlsx. Retirer le dessus de la plaque du bain selon et secouer excédent de solution. Plongez dans un bain d’eau de 200 mL DI pour 5 s et secouer de l’eau en excès. Plongez dans un bain d’eau différents 200 mL DI pour 5 s et secouer de l’eau en excès. Remplacer l’eau dans ces bains avant de plonger un autre sommet de la plaque. Utiliser l’air comprimé pour sécher complètement le dessus de la plaque. Placez le dessus de la plaque dans la partie supérieure de la bride de fabrication de plaque. Fermez doucement la pince plaque de fabrication pour appuyer simultanément sur le dessus de la plaque et le silicone. Pince au moins 1 h. Laissez la plaque guérir pendant 24 h à température ambiante avant utilisation, protégée de la poussière. 3. étirer une plaque Nettoyer les indenters.Remarque : Voir supplémentaire Figure 1. Préparer un sonicateur de bain style 60 W avec DI l’eau à température ambiante. Soutien du bloc de pénétrateur au-dessus du bain sonicateur, inversé de sorte que seulement les sommets de l’indenters sont submergés à une profondeur d’au moins 1 mm. soniquer les indenters pendant 8 min à 42 kHz. Séchez les indenters à l’air comprimé. Aligner le bloc du pénétrateur. Positionner une caméra avec une alimentation de phase au-dessus de l’appareil qui s’étend de sorte que c’est en regardant vers le bas sur le tableau de pénétrateur. Mettre l’accent sur les sommets des indenters.Remarque : La configuration décrite dans la Section 4, « Caractérisant la Membrane Stretch », est une configuration de la caméra possible pour cette tâche. Fixer une plaque sur la scène de l’appareil de blessures à l’aide des pinces de stade (Figure 1) et placez un plafonnier au-dessus de l’appareil.Remarque : Consultez la Table des matières pour le logiciel de contrôle d’instrument. Lancer le logiciel de contrôle d’instrument en cliquant sur l’icône du logiciel sur le Bureau de l’ordinateur qui contrôle l’appareil de la blessure. Exécutez le projet « in_vitro_neurotrauma.lvproj » en cliquant dessus dans la fenêtre de lancement. Dans la fenêtre projet, lancer la commande de mouvement et position des instruments virtuels tracker (VIs), qui sont appelés « motion_control.vi » et « position_tracker.vi », respectivement, en double-cliquant sur eux. Fermer la cage entourant le dispositif de la blessure. Appuyez sur le bouton « flèche » dans le coin supérieur gauche de la commande de mouvement VI pour exécuter la VI et cliquez sur « Près de bas » pour abaisser la diligence à moins de 2 mm de contacter les indenters. Cliquez sur le bouton « Stop » pour arrêter la VI.Mise en garde : Garder les mains hors de la civière lors de la manipulation de la caméra dans la cage. La cage doit être équipée d’un interrupteur de porte qui fournit la puissance de l’appareil d’étirement que lorsque la porte de la cage est fermée. Dans la fenêtre projet, faites un clic droit sur le « Axe 1 ». Cliquez sur « Panneau de Test interactif ». Dans la fenêtre qui s’ouvre, définissez la taille de l’étape à 50 µm en entrant ‘500’ unités dans le domaine de la « Position de la cible ». Cliquez sur le bouton « go » vert au bas de la fenêtre « Panneau de Test interactif » à plusieurs reprises jusqu’à ce que la plaque tout d’abord entre en contact avec n’importe quel indenters. Vous recherchez un contact avec l’image affichée par la caméra en direct. Remarque la position verticale stade signalée dans le coin supérieur gauche de la fenêtre de « Panel de Test interactif » ; Il s’agit de la première position de contact. Plus bas (comme indiqué au point 3.2.6) jusqu’à ce que chaque cupule a fait contact avec les indenters. Si nécessaire, déplacez la caméra pour voir la plaque entière et monter la scène (en spécifiant une Position négative « cible ») et vers le bas. Remarque la position verticale stade signalée dans le coin supérieur gauche de la fenêtre lorsque tous les messages sont en contact (c’est la position de coordonnées complètes). Notez la différence entre le premier contact et coordonnées complètes. Fermez le « panneau de Test interactif ». Exécutez le « motion control VI » (Voir l’étape 3.2.4) et cliquez sur « Top » pour déclencher la scène. Arrêter la commande de mouvement VI avec le bouton « Stop ». Une fois que la scène est au sommet de sa course, ouvrir la porte pour désactiver le périphérique. Ajuster les vis de réglage sur les coins du bloc avec pénétrateur. Desserrer la vis de réglage sur l’angle que fait le premier contact, à abaisser et serrez la vis opposée pour soulever l’angle que fait le dernier contact. Répétez le processus d’abaissement de la scène jusqu’à ce que la plaque entre en contact avec les indenters, inspectant les images contact pour tilt, soulevant la scène, et réglage (étape 3.2.9) le pénétrateur bloquer. Lorsque la scène et le bloc sont alignés, tous les indenters fera, contactez immédiatement. Ouvrir la porte pour désactiver le périphérique. Insérez les vis de retenue dans leurs trous du bloc de pénétrateur et serrez-les. Confirmer que le bloc soit de niveau avec les vis de fixation en place (pas 3.2.4-3.2.8). Prendre note de la position d’allure signalée par le « Panel de Test interactif » lorsque la plaque fait contact. Il s’agit de la position zéro pour des expériences de mise en retrait. Lubrifier les indenters. Si le bloc de pénétrateur juste a été mis en place et n’a pas encore été lubrifié, nettoyer un tapis en caoutchouc solide (7,5 x 11 cm x 1.5 mm) et un tampon de caoutchouc mousse molle, cellules fermées (7,5 x 11 cm x 3 mm) avec un chiffon imbibé d’éthanol de laboratoire. Laisser les sécher à l’air. Tremper un chiffon de laboratoire dans de l’huile de maïs et l’étaler sur le pad en caoutchouc solide pour une brillance mate. Placez le coussin de mousse sur la garniture en caoutchouc solide à transférer du pétrole sur le tampon de mousse. Placez un 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm en aluminium dalle sur le dessus de la garniture de mousse et de charger avec un poids de lest d’environ 360 g (p. ex., 6 tubes coniques chargés avec 45 mL d’eau de chaque) pour assurer le transfert cohérent d’huile du coussinet en caoutchouc solide pour le coussin de mousse. Permettre à 10 s pour l’huile de transférer à la garniture en caoutchouc mousse. Déplacer le coussinet de caoutchouc mousse sur le tableau du pénétrateur. Placer la plaque en aluminium et le poids de lestage au-dessus de celui-ci pour assurer le transfert cohérent de l’huile à la pointe des indenters. Permettre à 10 s pour l’huile de transférer aux indenters. Si aucun plaque n’a été étiré depuis le bloc de pénétrateur a été mis en place et lubrifiés pour la première fois, étirer une plaque d’essai avant de commencer l’expérience.Remarque : Cela empêchera toute incompatibilité entre le premier tronçon et ultérieures s’étend de l’expérience de confusion. Pour les tronçons suivants, répéter seulement pas 3.3.2-3.3.5 avant chaque étirement. Étirer une plaque. Lubrifier les indenters comme indiqué au point 3.3. Fixer la plaque sur la scène de l’appareil de blessures avec les pinces de la scène. Si la stérilité est nécessaire, ajuster la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer la surface de la culture à l’air ambiant. Abaisser la scène vers la position zéro à l’aide de la commande de mouvement de ‘VI’ (voir étapes 3.2.4-3.2.6) ; zéro-position est déterminé au cours de l’étape 3.2. Changer le nom du fichier dans le champ « file path » dans le « VI suivi de position » pour un nom de fichier unique, puis exécutez-le avec la touche « flèche » dans le coin supérieur gauche de cette fenêtre. Régler la profondeur et la durée de mise en retrait (en général de 1 à 4 mm et de 30 ms, respectivement, profondeur max. 5 mm, durée minimum 15 ms) dans les domaines de la « Blessure Duration (ms) » dans le « mouvement control panel VI » en cliquant sur les champs et en tapant dans la direction désirée et la « Blessure (mm) » valeurs. Exécutez le « mouvement control panel VI » et cliquez sur « Injure » mettre en retrait de la plaque. Déplacer la scène jusqu’au sommet de sa course en cliquant sur « Top ». Puis arrêter la VI avec la touche « Stop » et désactiver le périphérique de la lésion en ouvrant la porte. Inspecter l’historique de déplacement de la scène présentée dans la « position tracker VI » pour confirmer que le déplacement maximal spécifié a été appliqué. Faites un clic droit sur le graphique et cliquez sur « Exporter vers Excel ». Cliquez sur “fichier | Enregistrer “pour enregistrer les données. 4. caractérisation Membrane Stretch Peindre la niche en haut de chaque blanc de pénétrateur de prévoir un fond contrasté vidéographie de haute vitesse.ATTENTION : Ne pas peindre les jantes des indenters où ils font contact avec les plaques. 3D imprimer avec poly(lactic acid) (PLA), ou sinon fabriquer, un timbre cylindrique permettant de faire un point dans chaque puits. Faire le cylindre 5,9 mm de diamètre et 12,2 mm de hauteur, avec un diamètre de 1,5 mm saillie cylindrique et 1,0 mm de hauteur centrée sur le dessus.Remarque : Un modèle 3D imprimable ‘ timbre. STL’ est disponible sous forme de fichier supplémentaire. Plasma traiter la plaque droit-côté-vers le haut pour activer la surface de culture de cellules de silicone dans les puits pendant 60 s, tel que mentionné à l’étape 2.1. Placer la plaque sur un tapis de caoutchouc ou autre surface molle. Amorcer la petite protubérance sur le timbre (Voir l’étape 4.2) avec de l’encre du stylo marqueur permanent. Insérez le timbre dans le puits à tester et tapoter pour assurer le bon transfert de l’encre. Amorcer le timbre avant chaque cupule. Aligner le bloc avec pénétrateur et lubrifier les indenters de l’appareil de blessure (voir étapes 3.2-3.3). Fixer la plaque sur la scène de l’appareil de la blessure. Placez une lumière diffuse axiale au-dessus du dispositif de la blessure. Mettre en place une caméra à grande vitesse sur une perche sur le périphérique de la lésion, orientées directement vers le bas, avec l’objectif défini sur le plus petit diaphragme numéroté et allumez-le. Lancer le logiciel de la caméra sur l’ordinateur connecté à la caméra. Dans le cadre taux menu déroulant, sélectionnez images 2 000 par seconde et dans le volet déroulant menu, sélectionnez le temps d’exposition plus rapide, ce qui donne des images à fort contraste. Centre sur les puits en pointillés. Positionner la caméra de sorte que le champ de vision contient 12 puits dans une grille de 3 x 4.Remarque : Ce champ de vision offre un compromis optimal entre débit et résolution d’une image de 1 280 × 1 024. Abaissez la plaque au point zéro (voir étapes 3.2.4-3.2.6). Un seul clic le dossier touche sur le logiciel de la caméra afin qu’il dise « trigger dans ». Lancer le tracker position VI (étape 3.4.4). Allumez la lumière diffuse axiale. Retrait de la plaque comme décrit à l’étape 3.4.6. Éteignez la lumière diffuse axiale. Sur l’ordinateur de contrôle caméra, accédez à la fenêtre de 30-40 ms de l’enregistrement où survient l’indentation : faites glisser les flèches de début et de fin dans la barre de lecture de la vidéo à haute vitesse dans le logiciel de la caméra. Cliquez sur enregistrer, définissez le nom dans le champ « Nom de fichier », sélectionnez « TIFF » dans le champ « Format » et cliquez sur « Sauvegarder ». Regardez à travers la. Fichiers TIF pour les images les moins étiré (début) et plus tendu des États (mise en retrait de la crête). Pour mesurer la hauteur et la largeur des points dans les deux images, utilisez Fidji pour ouvrir les images du moins élevé et la crête stretch-by-side. À l’aide de l’outil de sélection rectangulaire par défaut, cliquez et glissez pour dessiner un rectangle autour d’un point dans l’image moins extensible. Mesurer la hauteur et la largeur avec ‘ Analyze | Mesure “. Répétez la procédure pour le point dans le même puits sur l’image de bout droit de pointe. Répéter pour le reste des puits. Calculer la souche lagrangien dans les directions x et y comme suit :NOTE : Ici, Exx est la souche de lagrangien dans la direction x , EAA est la souche de lagrangien dans la direction y , X est la largeur du point, Y est la hauteur de la dot, f désigne l’image finale (c’est-à-dire, l’image d’indentation de pointe), et j’ai désigne l’image initiale (c.-à-d., l’image mise en retrait préalable). La moyenne des deux valeurs pour déterminer la souche dans ce puits. 5. les cellules cultivées de placage Autoclave les bacs et les masses d’alourdissement qui seront utilisés pour la stérilisation. Plasma traiter le plaques à fond silicone droite-up pendant 60 s (reportez-vous à l’étape 2.1). Immédiatement, immerger les plaques dans les bacs stériles contenant de l’éthanol à 70 % pendant 15 min. Immerger les plaques dans une solution saline de stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans des bacs stériles séparés pendant 30 min. Aspirer les PBS des puits. Seulement séchez une plaque à la fois pour éviter les puits de perdre le traitement plasma.ATTENTION : Silicone plaques à fond fournissent la rétroaction tactile moins que des plaques rigides lors du pipetage et sont plus susceptibles de bloquer l’extrémité de la pipette. Ajouter 100 µL de 0,1 mg/mL poly-L-ornithine (OLP) par puits dans les plaques stérilisés. Incuber à température ambiante pendant 1 h. Rincer les puits deux fois avec 100 µL de PBS stérile, laissant le second lavage sur les puits jusqu’à ce que la suspension cellulaire est prête. Retirer la cuvette de hiPSCNs de stockage d’azote liquide à l’aide de gants de sécurité et placer sur la glace sèche. Transporter le flacon dans un bain d’eau de 37 ° C et rapidement décongeler pendant exactement 3 minutes. Pas agiter le flacon. Sous une hotte stérile, doucement transvaser le contenu du flacon dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 1 mL. Rincer le flacon vide cryogénique avec 1 mL de milieu de maintenance complète de la température ambiante (périphérique d’amarrage + supplément). Transférer le 1 mL de médias dans le tube de 50 mL goutte-à-goutte à environ une goutte par seconde. Agiter doucement le tube lors de l’ajout. Ajoutez 8 mL de milieu de maintenance complète de température ambiante pour le tube de 50 mL environ 2 gouttes/s. Boucher le tube et inverser 2 ou 3 fois. Compter les cellules avec un hémocytomètre. Calculer le volume du média supplémentaire nécessaire pour diluer la suspension cellulaire à 225 000 cellules/mL. Pipetez doucement la quantité de données (calculées ci-dessus) dans le tube de suspension de cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL. Ajouter 10 µL de 1 mg/mL de bouillon de laminine pour 1 mL de suspension cellulaire avec une micropipette µL 1 000 pour atteindre 10 µg/mL de laminine dans la suspension cellulaire. Aspirer en haut et en bas une fois avec la pointe utilisée pour la laminine, puis Boucher le tube et inverser le tube une fois. Aspirer les PBS des plaques, une plaque à la fois. Utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 100 µL de la suspension de cellules hiPSCN dans chaque puits. Les puits ont une zone de culture de 0,33 cm2, donc la densité des cellules surfacique est de 67 500 cellules/cm2. Reposer les plaques à température ambiante pendant 15 min après l’ensemencement pour promouvoir la pièce jointe. Pour éviter les vibrations du ventilateur de hotte de culture stériles, placer les plaques couvertes sur le banc de laboratoire. Incuber les cultures à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Effectuer un changement de support complet après 24 h, remplissage des puits avec 200 µL de médias de maintenance complète. Effectuer un demi médias changent de 100 µL/puits tous les 2-3 jours. 6. blessant Cultures Aligner le bloc avec pénétrateur et trouver la position zéro, comme indiqué au point 3.2. Lubrifier les indenters comme indiqué au point 3.3. Définissez le nom de fichier de l’historique de déplacement dans le « tracker position VI » (étape 3.4.4). Définissez les paramètres de blessure dans le « motion control VI » (étape 3.4.5). Prendre la plaque à être blessés hors de l’incubateur et la fixer sur la scène. Ajustez la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer les cultures à l’air ambiant. Abaissez la plaque au point zéro (mesures 3.2.4-3.2.6) à l’aide de la « motion control VI ». Lancer la « position tracker VI » (étape 3.4.4). Utilisez le contrôle de mouvement VI en retrait de la plaque (comme décrit à l’étape 3.4.6). Pour les tronçons de l’imposture, passez seulement cette étape. La scène de retour vers le haut de son amplitude de mouvement (Voir l’étape 3.4.7). Remettez la plaque dans l’incubateur. Inspecter et enregistrer la trace de déplacement (comme dans l’étape 3.4.8). 7. microscopie Préparer un 10 x solution 2 µg/mL Hoechst 33342 et 5 µg/ml calcéine AM dans les médias de l’entretien de la coloration. Chaque tache bien avec un pic de 20 µL de 10 x solution de coloration. Incuber pendant 15 minutes avec la tache à 37 ° C. Acquérir des images fluorescentes à grand champ. Utilisation conventionnelle FITC et DAPI filtre ensembles afin d’imager la calcéine AM et les signaux de Hoechst 33342, respectivement. Si la séquence d’imagerie multipuite prendra plus de 10 min, placer la plaque dans un incubateur haut de scène à maintenir la santé des cultures.Remarque : 10 X, 0,30 NA objectif offre suffisamment de détails pour la détermination de la viabilité cellulaire et de morphologie. Ajuster les gains afin d’assurer la bonne visualisation des neurites, même si cela provoque une saturation du soma beaucoup plus lumineux. Débat consacré aux images de cellules vivantes dans le canal vert de calcéine AM pour identifier le soma et les neurites. Utiliser des images nucléaires dans la couche de Hoechst 33342 bleue pour aider à l’identification du soma.