Summary

Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon införande mutanter

Published: May 04, 2018
doi:

Summary

Pseudomonas aeruginosa infektion orsakar betydande sjuklighet i utsatta värdar. Nonredundant transposon införande mutant biblioteket av P. aeruginosa stam PA14, betecknas som PA14NR inställd, underlättar analys av genen funktionalitet i flera olika processer. Presenteras här är ett protokoll för att skapa högkvalitativa kopior av PA14NR ställa mutant biblioteket.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa är en fenotypiskt och genotypically mångsidiga och anpassningsbara gramnegativa bakterie, allestädes närvarande i mänskliga miljöer. P. aeruginosa kan bilda biofilmer, utveckla antibiotikaresistens, producera virulensfaktorer och snabbt utvecklas i samband med en kronisk infektion. Således kan P. aeruginosa kan orsaka både akuta och kroniska, svårbehandlade infektioner, som skulle vilket resulterar i betydande sjuklighet i vissa patientgrupper. P. aeruginosa stam PA14 är en mänskliga kliniska isolat med bevarade genomets struktur som infekterar olika däggdjur och nonvertebrate värdar att göra PA14 ett attraktivt stam för att studera denna patogen. I 2006 genererades en nonredundant transposon införande mutant bibliotek som innehåller 5,459 mutanter motsvarar 4.596 förutspådda PA14 gener. Sedan dess har har fördelningen av PA14 biblioteket tillåtit forskarsamhället att bättre förstå funktionen av enskilda gener och komplexa vägar av P. aeruginosa. Underhåll av bibliotek integritet genom replikeringen kräver korrekt hantering och precisa tekniker. Därför presenterar detta manuskript protokoll som beskriver i detalj stegen inblandade i biblioteket replikering, bibliotek kvalitetskontroll och korrekt lagring av enskilda mutanter.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa är en fenotypiskt och genotypically mångsidiga och anpassningsbara gramnegativa bakterie som förekommer i jord, vatten, och de flesta mänskliga miljöer, samt hudens mikroflora. P. aeruginosa jämfört många bakteriearter, och har en relativt stor genomet hos 5.5-7 Mbp med höga G + C innehåll (65-67%). Dessutom en betydande del av dess gener är involverade i metabola anpassningsförmåga och är en del av regulatoriska nätverk, vilket möjliggör stor flexibilitet som svar på miljömässig stress1. P. aeruginosa uttrycker en uppsjö av virulensfaktorer, uppvisar benägenhet att bilda biofilmer, besitter förmågan att samordna Svaren genom flera quorum sensing vägar och visar en anmärkningsvärd kapacitet att utveckla antibiotikaresistens och tolerans2,3,4,5,6,7,8. Dessa attribut presenterar betydande utmaningar för behandling av infektioner orsakade av P. aeruginosa.

Kronisk P. aeruginosa infektioner kan förekomma vid många sjukdomstillstånd. Cystisk fibros (CF), en genetisk sjukdom som orsakas av mutation av genen Cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , resulterar i inspissated, infekterade sekret i luftvägarna, progressiv bronkiektasi och slutligen döden från andningssvikt9. Av vuxenlivet, är majoriteten av patienter med CF kroniskt infekterade med P. aeruginosa, som spelar en nyckelroll i sjuklighet och dödlighet associerade med denna sjukdom10. Dessutom, är patienter med svår Bränn skador11, tracheostomies12, ledplastik13eller inneboende katetrar14 i riskzonen för P. aeruginosa infektion relaterade till bakteriernas förmåga att bilda biofilmer och fly värd inflammatoriskt svar15. Vidare uppstår koloniseringen utan konkurrens efter en multi antibiotikaresistenta eller toleranta befolkning väljs genom ett brett spektrum, sekventiell antimikrobiell behandling12,16,17 , 18. bättre förstå patogenesen av P. aeruginosa kommer att ha betydande konsekvenser för många sjukdomstillstånd.

Flera P. aeruginosa kliniska isolat, inklusive stammar PAO1, PA103, PA14 och PAK, har studerats för att undersöka olika funktioner av P. aeruginosa patogenes. Stam PA14 är en kliniska isolat som tillhör en av de vanligaste klonala grupper världen över19,20 och har inte varit i stor utsträckning anpassade i laboratoriet. PA14is mycket virulent i ryggradsdjur modeller av infektion, med en märklig endotoxin profil21, pili strukturera22, patogenicitet öar23, typ III-sekretionssystemet (TTSS), cytotoxicitet mot däggdjurs celler24 och profiler i antibiotika resistens och uthållighet25. Dessutom PA14 är också mycket virulent i talrika värd-patogen modellsystem, inklusive växters blad infiltration modeller26,27,Caenorhabditis elegans infektion modeller28, 29, insekt modeller30,31, samt mus lunginflammation modeller32,33 och brännskada på huden modeller34.

Genome-wide mutant bibliotek är samlingar av syngena mutanter i onödiga gener som utgör mycket kraftfulla verktyg för att förstå biologin hos en organism genom att låta analys av geners funktion på genomisk nivå. Två nära-saturation transposon införande mutant bibliotek byggdes P. aeruginosa är för närvarande tillgängliga för distribution. Transposoner införande webbplatser har fastställts för båda biblioteken. Dessa så kallade nonredundant bibliotek underlätta genome-wide studier av bakteriestammar genom att avsevärt minska tiden och kostnaden inblandade i screening uncharacterized slumpmässiga transposon mutanter. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket, byggda i MPAO1 isolera stam PAO1 använder transposoner ärphoA/ hah och ärLindholm/ hah35, är curerad av Manoil lab, University of Washington. Biblioteket består av en sekvens-verifierade samling 9 437 transposon mutanter som ger brett genomet täckning och inkluderar två mutanter för de flesta gener36. Information om P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket finns på offentliga, internet-tillgängliga Manoil Labs webbplats på http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. De P. aeruginosa stam PA14 nonredundant transposon införande mutant bibliotek (PA14NR anges) konstruerade stam PA14 använder transposoner MAR2xT7 och TnphoA37 distribueras för närvarande av den institutionen för pediatrik vid Massachusetts General Hospital. PA14NR Set består av en samling av mer än 5 800 mutanter med enda transposon infogningar i onödiga gener37. Detaljer om byggandet av den PA14NR som beskrivs i offentliga, internet-tillgängliga webbplats http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, som också innehåller en mängd online-sökning verktyg för att underlätta användningen av PA14NR Ställa in.

Den ursprungliga PA14NR Set består 5,459 mutanter, utvalda från ett omfattande bibliotek med cirka 34.000 slumpmässiga transposon införande mutanter, som motsvarar 4.596 förutspådda PA14 gener som representerar 77% av alla förväntade PA14 gener37. Sedan byggandet av biblioteket i 2006 lades nya mutanter, och för närvarande PA14NR Set innehåller mer än 5 800 mutanter38 som representerar cirka 4.600 PA14 gener. Majoriteten av PA14 transposon mutanter genererades i de vildtyp bakgrund37. Detaljer om varje medlem av muterade bibliotek, inklusive genetiska bakgrund, finns antingen genom söka online-databas, eller genom att ladda ner på Nonredundant bibliotek kalkylbladet, båda funktioner som är tillgängliga på webbplatsen PA14 (http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Majoriteten av mutanter har skapats med hjälp av MAR2xT7 (MrT7) transposon, med en liten uppsättning som skapats med hjälp av de TnPhoA (phoA) transposon37. Varje transposon har en antibiotikaresistens kassett, som möjliggör mutant urval med gentamicin (MrT7) eller kanamycin (phoA). Den PA14NR uppsättningen av mutanter lagras i sextio-tre 96 brunnar och inkluderar två ytterligare 96 brunnar kontroll pläterar, som består av wild typ PA14 inokuleras och uninoculated brunnar interkalenderat i ett förinställt mönster. Plattan med 96 brunnar formatet parat med online-sökning verktyg kraftigt underlättar anpassade utvecklingen av screening analyser som tillåter användare att enkelt identifiera gener associerade med muterade fenotyper. De online-sökning verktyg kommer också att underlätta sökning och val av ytterligare relevanta mutanter som krävs för fortsatta studier.

PA14 och PAO1 transposon mutant biblioteken är mycket viktiga globala resurser för det vetenskapliga samfundet, och de kompletterar varandra i validera okänd geners funktion och vägar av denna bakterie patogen. Tillfällighet, eftersom byggandet av den PAO1 och PA14 transposon mutation biblioteken, har full-DNA sekvensering genomanalys av många P. aeruginosa -isolat visat att PAO1 och PA14 tillhör olika stora subclades av den P. aeruginosa fylogeni7,39,40,41. Eftersom klinisk P. aeruginosa -isolat finns undergrupper fördelade fylogenin, det faktum att PAO1 och PA14 tillhör olika P. aeruginosa och förbättrar värdet av de två transposon mutation biblioteken för jämförande studier.

Publikationer som beskriver byggandet och screening av bakteriell mutant bibliotek, inklusive P. aeruginosa bibliotek35,finns37,42, tillgängliga i litteraturen. Men, till bäst av vår kunskap, inga publicerade protokoll som beskriver detaljerade förfaranden och tekniker som används för replikering, underhåll och validering av bakteriell mutant bibliotek finns tillgängliga.

Den metod som beskrivs i denna publikation beskriver en uppsättning av tre protokoll som underlättar användning och underhåll av PA14NR Set. Det första protokollet beskriver replikering av biblioteket som rekommenderas till mottagare av PA14NR Set. Det andra protokollet innehåller riktlinjer för strimmor, växande och lagra enskilda mutanter identifieras med hjälp av PA14NR Set. Det tredje protokollet beskriver kvalitetskontroll tekniker, inklusive PCR-amplifiering av fragment från transposon mutanter och efterföljande sekvensering att bekräfta mutant identitet. Denna uppsättning protokoll kan också anpassas för replikering och underhåll av andra bakteriella mutant bibliotek eller samlingar. Replikering av bakteriell mutant bibliotek eller samlingar är mycket klokt att bevara integriteten i ”originalet” (ursprungliga kopian fick). Replikering av flera kopior av PA14NR Set för rutinmässig användning minimerar sannolikheten för interwell kontaminering av huvudkopia.

Protocol

FÖRSIKTIGHET: Utnyttja standard BSL-2 säkerhetsåtgärder vid hantering av P. aeruginosa, mänskliga patogener. Om du är privatperson med nedsatt immunförsvar eller har något medicinskt tillstånd som ökar din känslighet för bakteriell infektion, ta särskild försiktighet när du arbetar med s. aeruginosa. Konsultera biosäkerhet kontoret i din institution och skaffa godkännande från din läkare innan du börjar arbeta med den den PA14 NR Ställ eller muterade bibliotek av bakteriella patogen…

Representative Results

Tolv nya kopior av PA14NR Set replikerades använder protokollet som jag, och en kvalitetskontroll bedömning av de nya kopior som genereras utfördes med hjälp av protokoll III. PA14NR ställa in mutant tallrikar tillsammans med kontrollplattor, som består av vildtyp PA14 inokuleras och uninoculated brunnar interkalenderat i ett förinställt mönster (figur 4A), replikerades efter metodik som be…

Discussion

P. aeruginosa PA14NR är en värdefull resurs för forskarsamhället. Enligt mars 2017 datamängden från Clarivate Analytics grundläggande vetenskap indikatorer databas, Liberati o.a. (2006) 37, som beskriver byggandet av PA14NR Set, rankas i den översta 1% av mikrobiologi publikationer. Google Scholar rapporterar över 600 citeringar av den Liberati o.a. (2006) original-manuskript från och med augusti 2017. Biblioteket har spelat en viktig roll i att klarl?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Lisa Philpotts av MGH Treadwell virtuellt bibliotek för hennes vägledning i databas sökning. Detta arbete fick stöd av cystisk fibros Foundation (YONKER16G0 och HURLEY16G0) och NIH NIAID (BPH och ADE: R01 A1095338).

Materials

Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels – CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

Referencias

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016)
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. . Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. . . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Play Video

Citar este artículo
Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).

View Video