Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa belastning PA14 Transposon innsetting mutanter

Pseudomonas aeruginosa er en svært genotypically variert og tilpasningsdyktig Gram-negative bakterie stede i jord, vann, og de fleste mennesker miljøer, samt hud mikroflora. Sammenlignet med mange bakteriell arter, har P. aeruginosa en relativt stor genomet av 5.5-7 Mbp med høye G + C innhold (65-67%). Videre en betydelig andel av sine gener består av metabolske tilpasningsevne og er en del av regulatoriske nettverk, gir stor fleksibilitet som svar på miljøstress¹. P. aeruginosa uttrykker en mengde virulens faktorer, utstillinger proclivity å skjemaet biofilm, har muligheten til å koordinere reaksjonene gjennom flere quorum sensing veier og viser en bemerkelsesverdig evne til å utvikle antibiotikaresistens og toleranse^{2,3,4,5,6,7,8}. Disse attributtene presenterer betydelige utfordringer for behandling av infeksjoner forårsaket av P. aeruginosa.

Kronisk P. aeruginosa infeksjoner kan oppstå i mange sykdom stater. Cystisk fibrose (CF), en genetisk sykdom forårsaket av mutasjon av Cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR) genet, resulterer i inspissated, infiserte sekret i luftveiene, progressiv bronkiektasier og til slutt, død fra respirasjonssvikt⁹. Av voksen alder, er fleste pasienter med CF kronisk infisert med P. aeruginosa, som spiller en nøkkelrolle i sykelighet og dødelighet forbundet med denne sykdommen¹⁰. I tillegg er pasienter med alvorlig brenne skader¹¹, tracheostomies¹², felles erstatninger¹³eller iboende katetre¹⁴ utsatt for P. aeruginosa infeksjon gjelder bakterier evne til skjemaet biofilm og flukt vert inflammatorisk svar¹⁵. Videre skjer kolonisering uten konkurranse etter flere antibiotika resistente eller tolerant innbyggere er valgt gjennom bredspektret, sekvensielle antimikrobielle behandling^{12,16,17 , 18}. bedre forståelse patogenesen av P. aeruginosa vil ha viktige implikasjoner for mange sykdom stater.

Flere P. aeruginosa kliniske isolater, inkludert stammer PAO1, PA103, PA14 og PAK, har blitt grundig studert for å undersøke ulike funksjoner av P. aeruginosa patogenesen. Belastning PA14 er en kliniske isolere som tilhører en av de vanligste klonal grupper verdensomspennende^19,20 og har ikke vært mye passaged i laboratoriet. PA14is svært virulente i virveldyr modeller av infeksjon, med en kjent endotoxin profil²¹, pili struktur²², virusets øyene²³, type III sekresjon system (TTSS), cytotoksisitet mot pattedyr celler²⁴ og profiler i antibiotikumet motstand og utholdenhet²⁵. Videre PA14 er også svært virulente i mange vert-patogen modellsystemer, inkludert anlegg blad infiltrasjon modeller^26,27,Caenorhabditis elegans infeksjon modeller^{28, 29}, insekt modeller^30,31, samt mus lungebetennelse modeller^32,33 og solbrenthet modeller³⁴.

Genomet hele mutant biblioteker er samlinger av isogenic mutanter i unødvendige gener som utgjør svært kraftig verktøy for å forstå en organisme biologi ved analyse av gen funksjon i genomisk skala. To nær metning transposon innsetting mutant biblioteker i s. aeruginosa er tilgjengelige for distribusjon. Innsetting nettstedene til transposons er funnet for begge bibliotekene. Disse såkalte nonredundant bibliotekene lette genomet-omfattende studier av bakteriell stammer betydelig reduserer tiden og kostnadene involvert i screening uncharacterized tilfeldig transposon mutanter. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket bygget i MPAO1 isolere belastning PAO1 bruker transposons erphoA/ hah og erlacZ/ hah er³⁵, kuratert av Manoil lab, University of Washington. Biblioteket består av en sekvens-verifiserte samling av 9,437 transposon mutanter som gir bred genomet dekning og inkluderer to mutanter for de fleste gener³⁶. Informasjon om P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket er tilgjengelig på offentlige, Internett-tilgjengelige Manoil lab nettsted på http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa belastning PA14 nonredundant transposon innsetting mutant bibliotek (PA14NR sett) i belastning PA14 bruker transposons MAR2xT7 og TnphoA³⁷ er distribuert av Department of Pediatrics ved Massachusetts General Hospital. PA14NR Set består av en samling av mer enn 5800 mutanter med enkelt transposon innsettinger i unødvendige gener³⁷. Detaljer om bygging av PA14NR Set er beskrevet i det offentlige, Internett-tilgjengelige området http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, som også inneholder en rekke online søkeverktøy for å forenkle bruken av PA14NR Sett.

Den opprinnelige PA14NR Set består 5,459 mutanter, valgt fra et omfattende bibliotek av ca 34000 tilfeldig transposon innsetting mutanter, som tilsvarer 4,596 spådd PA14 gener som representerer 77% av alle anslåtte PA14 gener³⁷. Siden byggingen av biblioteket i 2006 new mutantene ble lagt, og tiden PA14NR Set inkluderer flere 5800 mutanter³⁸ som representerer ca 4600 PA14 gener. Fleste PA14 transposon mutanter ble generert i vill type bakgrunn³⁷. Detaljer om hvert medlem av mutant biblioteket, inkludert genetisk bakgrunn, er tilgjengelige via søke nettdatabasen, eller ved å laste ned Nonredundant biblioteket regnearket, begge funksjonene som er tilgjengelige på PA14 nettsted (http:// pa14.mgh.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.CGI). Fleste av mutanter ble opprettet ved hjelp av MAR2xT7 (MrT7) transposon, med en liten sette laget med TnPhoA (phoA) transposon³⁷. Hver transposon har en antibiotikaresistens kassett, som tillater mutant utvalg gentamicin (MrT7) eller kanamycin (phoA). PA14NR settet av mutanter lagres i sekstitre 96-brønns plater og inneholder to ekstra 96-brønns kontroll platene som består av vill-type PA14 inokulert og uninoculated brønner under Sommer i et forhåndsinnstilt mønster. 96-brønns plate formatet sammen med online søkeverktøyene sterkt forenkler egendefinerte utviklingen av screening analyser det tillate brukernes å lett identifisere tilblivelse tilknyttet mutant fenotyper. Online søkeverktøyene også forenkle søk og valg av flere relevante mutanter kreves for videre studier.

PA14 og PAO1 transposon mutant bibliotekene er svært viktige globale ressurser for det vitenskapelige samfunnet, og de utfyller hverandre i validere funksjonen av ukjent gener og stier av denne bakteriell patogen. Coincidentally, siden byggingen av PAO1 og PA14 transposon mutasjon bibliotekene, har full-genome DNA sekvensering analyse av mange P. aeruginosa isolerer vist at PAO1 og PA14 tilhører forskjellige store subclades av P. aeruginosa phylogeny^7,39,40,41. Fordi klinisk P. aeruginosa isolerer finnes distribuert gjennom fylogeni, det faktum at PAO1 og PA14 tilhører forskjellige P. aeruginosa undergrupper øker verdien av to transposon mutasjon bibliotekene for komparative studier.

Publikasjoner som beskriver bygging og screening av bakteriell mutant biblioteker, inkludert P. aeruginosa biblioteker^35,er^37,42, lett tilgjengelig i litteraturen. Til best av vår kunnskap er ingen publiserte protokoller som beskriver detaljert prosedyrer og teknikker for replikering, vedlikehold og validering av bakteriell mutant biblioteker imidlertid tilgjengelige.

Metodene som er beskrevet i denne publikasjonen beskriver et sett med tre protokoller som forenkler bruk og vedlikehold av PA14NR Set. Første protokollen beskriver replikering av biblioteket som anbefalt til mottakere av PA14NR Set. Andre protokollen inneholder retningslinjer for striper, vokser og lagring av personlige mutanter identifisert ved hjelp av PA14NR Set. Tredje protokollen beskriver kvalitetskontroll teknikker, inkludert PCR forsterkning av fragmenter fra transposon mutanter og påfølgende sekvensering å bekrefte mutant identitet. Dette settet med protokoller kan også tilpasses for replikering og vedlikehold av andre bakterielle mutant biblioteker eller samlinger. Replikering av bakteriell mutant biblioteker eller samlinger er svært anbefales å opprettholde dataintegriteten “master kopi” (originalversjonen mottatt). Replikering av flere kopier av PA14NR Set for rutine laboratoriebruk reduserer sannsynligheten for interwell forurensning av hovedkopien.