Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon införande mutanter

Pseudomonas aeruginosa är en fenotypiskt och genotypically mångsidiga och anpassningsbara gramnegativa bakterie som förekommer i jord, vatten, och de flesta mänskliga miljöer, samt hudens mikroflora. P. aeruginosa jämfört många bakteriearter, och har en relativt stor genomet hos 5.5-7 Mbp med höga G + C innehåll (65-67%). Dessutom en betydande del av dess gener är involverade i metabola anpassningsförmåga och är en del av regulatoriska nätverk, vilket möjliggör stor flexibilitet som svar på miljömässig stress¹. P. aeruginosa uttrycker en uppsjö av virulensfaktorer, uppvisar benägenhet att bilda biofilmer, besitter förmågan att samordna Svaren genom flera quorum sensing vägar och visar en anmärkningsvärd kapacitet att utveckla antibiotikaresistens och tolerans^{2,3,4,5,6,7,8}. Dessa attribut presenterar betydande utmaningar för behandling av infektioner orsakade av P. aeruginosa.

Kronisk P. aeruginosa infektioner kan förekomma vid många sjukdomstillstånd. Cystisk fibros (CF), en genetisk sjukdom som orsakas av mutation av genen Cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , resulterar i inspissated, infekterade sekret i luftvägarna, progressiv bronkiektasi och slutligen döden från andningssvikt⁹. Av vuxenlivet, är majoriteten av patienter med CF kroniskt infekterade med P. aeruginosa, som spelar en nyckelroll i sjuklighet och dödlighet associerade med denna sjukdom¹⁰. Dessutom, är patienter med svår Bränn skador¹¹, tracheostomies¹², ledplastik¹³eller inneboende katetrar¹⁴ i riskzonen för P. aeruginosa infektion relaterade till bakteriernas förmåga att bilda biofilmer och fly värd inflammatoriskt svar¹⁵. Vidare uppstår koloniseringen utan konkurrens efter en multi antibiotikaresistenta eller toleranta befolkning väljs genom ett brett spektrum, sekventiell antimikrobiell behandling^{12,16,17 , 18}. bättre förstå patogenesen av P. aeruginosa kommer att ha betydande konsekvenser för många sjukdomstillstånd.

Flera P. aeruginosa kliniska isolat, inklusive stammar PAO1, PA103, PA14 och PAK, har studerats för att undersöka olika funktioner av P. aeruginosa patogenes. Stam PA14 är en kliniska isolat som tillhör en av de vanligaste klonala grupper världen över^19,20 och har inte varit i stor utsträckning anpassade i laboratoriet. PA14is mycket virulent i ryggradsdjur modeller av infektion, med en märklig endotoxin profil²¹, pili strukturera²², patogenicitet öar²³, typ III-sekretionssystemet (TTSS), cytotoxicitet mot däggdjurs celler²⁴ och profiler i antibiotika resistens och uthållighet²⁵. Dessutom PA14 är också mycket virulent i talrika värd-patogen modellsystem, inklusive växters blad infiltration modeller^26,27,Caenorhabditis elegans infektion modeller^{28, 29}, insekt modeller^30,31, samt mus lunginflammation modeller^32,33 och brännskada på huden modeller³⁴.

Genome-wide mutant bibliotek är samlingar av syngena mutanter i onödiga gener som utgör mycket kraftfulla verktyg för att förstå biologin hos en organism genom att låta analys av geners funktion på genomisk nivå. Två nära-saturation transposon införande mutant bibliotek byggdes P. aeruginosa är för närvarande tillgängliga för distribution. Transposoner införande webbplatser har fastställts för båda biblioteken. Dessa så kallade nonredundant bibliotek underlätta genome-wide studier av bakteriestammar genom att avsevärt minska tiden och kostnaden inblandade i screening uncharacterized slumpmässiga transposon mutanter. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket, byggda i MPAO1 isolera stam PAO1 använder transposoner ärphoA/ hah och ärLindholm/ hah³⁵, är curerad av Manoil lab, University of Washington. Biblioteket består av en sekvens-verifierade samling 9 437 transposon mutanter som ger brett genomet täckning och inkluderar två mutanter för de flesta gener³⁶. Information om P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket finns på offentliga, internet-tillgängliga Manoil Labs webbplats på http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. De P. aeruginosa stam PA14 nonredundant transposon införande mutant bibliotek (PA14NR anges) konstruerade stam PA14 använder transposoner MAR2xT7 och TnphoA³⁷ distribueras för närvarande av den institutionen för pediatrik vid Massachusetts General Hospital. PA14NR Set består av en samling av mer än 5 800 mutanter med enda transposon infogningar i onödiga gener³⁷. Detaljer om byggandet av den PA14NR som beskrivs i offentliga, internet-tillgängliga webbplats http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, som också innehåller en mängd online-sökning verktyg för att underlätta användningen av PA14NR Ställa in.

Den ursprungliga PA14NR Set består 5,459 mutanter, utvalda från ett omfattande bibliotek med cirka 34.000 slumpmässiga transposon införande mutanter, som motsvarar 4.596 förutspådda PA14 gener som representerar 77% av alla förväntade PA14 gener³⁷. Sedan byggandet av biblioteket i 2006 lades nya mutanter, och för närvarande PA14NR Set innehåller mer än 5 800 mutanter³⁸ som representerar cirka 4.600 PA14 gener. Majoriteten av PA14 transposon mutanter genererades i de vildtyp bakgrund³⁷. Detaljer om varje medlem av muterade bibliotek, inklusive genetiska bakgrund, finns antingen genom söka online-databas, eller genom att ladda ner på Nonredundant bibliotek kalkylbladet, båda funktioner som är tillgängliga på webbplatsen PA14 (http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Majoriteten av mutanter har skapats med hjälp av MAR2xT7 (MrT7) transposon, med en liten uppsättning som skapats med hjälp av de TnPhoA (phoA) transposon³⁷. Varje transposon har en antibiotikaresistens kassett, som möjliggör mutant urval med gentamicin (MrT7) eller kanamycin (phoA). Den PA14NR uppsättningen av mutanter lagras i sextio-tre 96 brunnar och inkluderar två ytterligare 96 brunnar kontroll pläterar, som består av wild typ PA14 inokuleras och uninoculated brunnar interkalenderat i ett förinställt mönster. Plattan med 96 brunnar formatet parat med online-sökning verktyg kraftigt underlättar anpassade utvecklingen av screening analyser som tillåter användare att enkelt identifiera gener associerade med muterade fenotyper. De online-sökning verktyg kommer också att underlätta sökning och val av ytterligare relevanta mutanter som krävs för fortsatta studier.

PA14 och PAO1 transposon mutant biblioteken är mycket viktiga globala resurser för det vetenskapliga samfundet, och de kompletterar varandra i validera okänd geners funktion och vägar av denna bakterie patogen. Tillfällighet, eftersom byggandet av den PAO1 och PA14 transposon mutation biblioteken, har full-DNA sekvensering genomanalys av många P. aeruginosa -isolat visat att PAO1 och PA14 tillhör olika stora subclades av den P. aeruginosa fylogeni^7,39,40,41. Eftersom klinisk P. aeruginosa -isolat finns undergrupper fördelade fylogenin, det faktum att PAO1 och PA14 tillhör olika P. aeruginosa och förbättrar värdet av de två transposon mutation biblioteken för jämförande studier.

Publikationer som beskriver byggandet och screening av bakteriell mutant bibliotek, inklusive P. aeruginosa bibliotek^35,finns^37,42, tillgängliga i litteraturen. Men, till bäst av vår kunskap, inga publicerade protokoll som beskriver detaljerade förfaranden och tekniker som används för replikering, underhåll och validering av bakteriell mutant bibliotek finns tillgängliga.

Den metod som beskrivs i denna publikation beskriver en uppsättning av tre protokoll som underlättar användning och underhåll av PA14NR Set. Det första protokollet beskriver replikering av biblioteket som rekommenderas till mottagare av PA14NR Set. Det andra protokollet innehåller riktlinjer för strimmor, växande och lagra enskilda mutanter identifieras med hjälp av PA14NR Set. Det tredje protokollet beskriver kvalitetskontroll tekniker, inklusive PCR-amplifiering av fragment från transposon mutanter och efterföljande sekvensering att bekräfta mutant identitet. Denna uppsättning protokoll kan också anpassas för replikering och underhåll av andra bakteriella mutant bibliotek eller samlingar. Replikering av bakteriell mutant bibliotek eller samlingar är mycket klokt att bevara integriteten i ”originalet” (ursprungliga kopian fick). Replikering av flera kopior av PA14NR Set för rutinmässig användning minimerar sannolikheten för interwell kontaminering av huvudkopia.