Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca^{2 +}-proyección de imagen y pruebas de degranulación

MCs juega un papel destacado durante las respuestas inmunitarias innatas y adquiridas. Específicamente, MCs participa en la muerte de patógenos, como bacterias y parásitos y también degradan péptidos endógenos potencialmente tóxicos o componentes de venenos (para revisión ver Galli et al. 2008¹). El papel fisiológico de MCs en la inmunidad innata y adaptativa es objeto de acalorado debate. Por lo tanto, las numerosas discrepancias de datos en los estudios realizados con diferentes modelos de ratón deficientes en MC requieren una reevaluación sistemática de las funciones inmunológicas de MCs más allá de alergia². MCs madurados se localizan principalmente en tejidos y órganos como la piel, el pulmón y el intestino y generalmente sólo se encuentran en pequeña cantidad en la sangre. MCs derivan de precursores hematopoyéticos, como progenitores de MC y completar su diferenciación y maduración en los microambientes de casi todos los tejidos vascularizados¹. Factor derivado de células T interleukin (IL) -3 selectivamente promueve la viabilidad, proliferación y diferenciación de una población de pluripotent del ratón MCs de sus progenitores hematopoyéticos³. Factor de células madre (SCF) es producida por células estructurales en los tejidos y desempeña un papel crucial en la MC desarrollo, supervivencia, la migración y función⁴. Las propiedades de los MCs pueden diferir dependiendo de su capacidad para sintetizar y almacenar diversas proteasas o proteoglicanos. En ratones, se distinguen el tipo de tejido conectivo denominada MCs de MCs mucosa según su localización anatómica, morfología y contenido de heparina y proteasas⁵.

En MCs, un aumento del libre citosólico Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]) es indispensable para la degranulación y producción de eicosanoides, así como para la síntesis de citoquinas y activación de factores de transcripción en respuesta a antígenos y varios secretagogos⁶. Un objetivo importante aguas abajo de estos estímulos es la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato inositol 1,4,5-trifosfato y diacilglicerol (DAG). DAG activa la proteína quinasa C y IP3 libera iones de Ca^{2 +} desde el retículo endoplásmico. Agotamiento de estas tiendas activa Ca^{2 +} afluencia vía membrana plasmática Ca^{2 +} , llevando a almacenar calcio operados entrada (SOCE). Este proceso es evocado a través de la interacción del Ca^{2 +}-sensor, interacción stromal molecule-1 (Stim1), en el retículo endoplásmico con Orai1⁷ , así como a través de la activación del canal de (TRPC) canónico potencial transitorio del receptor proteínas (para revisión ver Freichel et al. 2014⁸) en la membrana plasmática.

Para estudiar el papel fisiológico de estos canales, varios farmacológico (uso de bloqueadores de los canales) o enfoques genéticos se utilizan típicamente. En este último caso, supresión de la expresión de la proteína se obtiene dirigiéndose a mRNA (caída) o ADN genómico con global o tejidos específicos⁹ canceladura de un exón codificación un poro formando la subunidad de un canal (eliminatorias). La disponibilidad de un bloqueador con suficiente especificidad para estos canales es limitada. Además, el enfoque de precipitación requiere un control cuidadoso de su efectividad mediante, por ejemplo., Western blot análisis y se ve obstaculizada por la falta de disponibilidad de anticuerpos específicos para la proteína de canal específicos en muchos casos. Así, el uso de modelos de ratón knockout todavía se considera como el estándar de oro para dicho análisis. Un modelo preferido en vitro para la investigación de las funciones de la MC es cultivo de CMP que pueden ser aisladas ex vivo como una población totalmente madura (a diferencia de la distinción de MCs en vitro de, por ejemplo., células de médula ósea)¹⁰ . En comparación con la médula ósea derivada de MCs (BMMCs), que también se utilizan para estudiar la función de MC en vitro, la estimulación de FcεRI y beta-hexosaminidase liberación aumenta 8 y 100-fold en CMP, respectivamente. En este artículo, describimos un método de aislamiento y cultivo de CMP murinas, que permite para obtener después de 2 semanas de cultivo de un elevado número de puro tejido conectivo tipo MCs, suficientes para su posterior análisis.

A pesar de recientes avances en el desarrollo y aplicación de indicadores genético codificados calcio, su uso es aún limitado por dificultades en la entrega de genes a las células diana, específicamente, en células altamente especializadas tales como MCs cultivadas primarios. Además, este grupo de indicadores fluorescentes de [Ca^{2 +}] las mediciones aún carece de tintes radiométrica con un alto rango dinámico. Por estas razones, el método preferido para la medición radiométrica [Ca^{2 +}] sigue siendo el uso del tinte fluorescente “Fura-2”¹¹.

Actualmente, el más de uso general enfoque para la evaluación de MC activación y degranulación es la medida de actividad de β-hexosaminidasa. Β-hexosaminidasa, un mediador alérgico, es uno de los componentes de gránulo de MC que es lanzado conjuntamente con histamina en proporción constante de MCs¹². Β-hexosaminidasa se puede medir fácilmente y con precisión a través de su reacción con un sustrato específico, que produce una cantidad mensurable de un producto colorigenic que es fácilmente detectable en un ensayo colorimétrico de microplacas. En este artículo, se divulga una aplicación de esta técnica para el análisis de las CMP degranulación en respuesta a una variedad de estímulos.

Agregación del receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidad (FcɛRI) activa en MCs una vía de señalización intracelular versátil, conduce a una liberación del contenido de gránulos secretores en el espacio extracelular circundante. Además el antígeno específico, muchos otros estímulos pueden activar MCs para liberar una gran variedad de mediadores inmunomoduladores, como complemento anaphylatoxins (e.g., C3a y C5a)¹³, el péptido vasoconstrictor la endotelina 1 (ET1)¹⁴ , así como numerosas sustancias catiónicas y drogas provocando reacciones pseudoallergic (e.g., icatibant)¹⁵ atando a MRGPRX2¹⁶. Vías de señalización intracelular implicados en la Desgranulación inducida por MRGPR MCs mal se caracterizan con respecto a la señalización intracelular mediada por el FcɛRI; estas vías sólo comenzaron a ser estudiado intensamente durante los últimos pocos años¹⁷ después de la identificación del receptor del¹⁶. Los membrana plasmática canales del ion en la entrada de calcio seguido por estimulación MRGPRX2 siguen siendo en gran parte, para ser entendido. Por lo tanto, el presente artículo se centra también en la señalización intracelular del calcio y degranulación de los MCs estimulado con agonistas de la MRGPR.