Une méthode pour la mesure de la fonction des glandes salivaires chez les souris
Summary
Hypofonction de la glande salivaire est une conséquence fréquente du traitement de la maladie et le rayonnement auto-immune. L’évaluation reproductible de fonction des glandes salivaires chez les modèles murins de ces maladies est un défi technique. Ici, on décrit une méthode simple pour la mesure précise et reproductible de la production de salive chez les souris.
Abstract
Les patients atteints du syndrome de Sjögren, une maladie auto-immune affectant les glandes exocrines, développent une inflammation des glandes salivaires et ont réduit la production de salive. De même, la production de salive est gravement compromise chez les patients recevant des traitements de radiothérapie pour les cancers de la tête et du cou. Les modèles de rongeurs, mis au point pour imiter ces conditions cliniques, facilitent la compréhension de la pathogenèse de la maladie et permettant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, la capacité pour mesurer la fonction des glandes salivaires chez les modèles animaux avec précision, de façon reproductible et à plusieurs reprises est essentielle. S’appuyant sur des procédures décrites précédemment dans la littérature, a développé une méthode qui remplit ces critères et a été utilisé pour évaluer la fonction des glandes salivaires chez les souris. Un autre avantage de cette nouvelle méthode est qu’elle est facilement maîtrisée et a peu de variation entre opérateurs. Fonction des glandes salivaires est évaluée comme la quantité (poids ou volume) ou le taux (mL/min) de la salive produite en réponse à la stimulation de la pilocarpine. La salive est une bonne source pour l’analyse de la teneur en protéines, les concentrations de l’immunoglobuline et autres biomolécules.
Introduction
Les glandes salivaires produisent la salive en réponse à divers stimuli neurologiques et mécanique1. Les stimuli sont transportés à travers le système nerveux sympathique et parasympathique sur les récepteurs adrénergiques et cholinergiques dans la glande. Pilocarpine est un agent cholinergique, para-sympathomimétique qui agit principalement sur les récepteurs muscariniques. Dans la glande salivaire, il induit la production de salive en agissant sur les récepteurs muscariniques de l’acétylcholine M31. La production de salive après l’administration de pilocarpine est un indicateur de la capacité des glandes salivaires à répondre à la stimulation et est couramment utilisée comme mesure de la fonction des glandes salivaires.
Une mesure précise de la production de salive est critique dans l’étude des maladies des glandes salivaires, y compris le syndrome de Sjögren2 et rayonnements des blessures suite de traitement du cancer de tête et le cou3. Plusieurs méthodes différentes ont été développées pour mesurer la production de salive chez les rongeurs. Il s’agit de canulation directe du excréteur salivaire conduit4, la collecte de salive de la cavité buccale sous vide5et la collection à l’aide de capillaires de verre6 ou une micropipette7,,8, 9. direct canulation du canal salivaire fournit la plus exacte et pure de salive. Toutefois, il s’agit d’une procédure techniquement difficile, et le potentiel de causer des lésions canalaires n’empêche collections répétitives de salive de l’animal même. Collecte de salive sous vide peut conduire à des résultats variables en raison de l’assèchement de la salive dans le tube. Cette perte est encore exagérée chez les souris avec diminution de la salivation. Capillaires en verre permettent la collecte de salive pour les analyses suivantes, cependant, changements de viscosité de la salive sécrétée dans l’état du malade permet un remplissage efficace du capillaire. Plus loin, tentatives de balayer la cavité buccale afin de recueillir la salive résiduelle peuvent entraîner blessures. La méthode de la pipette permet de collection complète, et pour le même opérateur, il est remarquablement constant entre les expériences. Toutefois, pour des raisons inconnues, cette méthode montre une variation importante entre les différents opérateurs. Par conséquent, pour permettre des comparaisons appropriées, il devient impératif que le même opérateur effectue toutes les expériences liées à un projet spécifique. De toute évidence, il s’agit d’un inconvénient majeur pour un laboratoire.
Pour surmonter ces problèmes, il a développé une méthode que les méthodes de collecte de salive combine utilisé pour les humains et les rongeurs. La méthode de l’écouvillon, décrite ci-dessous pour mesurer le volume de salive induite par la pilocarpine est simple, reproductible, non influencé par l’opérateur et peut être effectuée à plusieurs reprises chez le même animal. En outre, il permet de recueillir la salive pour les analyses subséquentes des protéines, les immunoglobulines ou les autres biomolécules.
Protocol
Representative Results
Discussion
La production de salive est un processus complexe et dépend de nombreux facteurs. Par conséquent, la fonction des glandes salivaires chez les animaux de laboratoire de mesure peut être un défi. Un autre défi est que des mesures répétées de la fonction des glandes salivaires chez le même animal sont tenus d’établir l’apparition de la maladie ou de démontrer la récupération après un traitement.
L’écouvillonnage décrite dans le présent rapport est techniquement simple à r?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été financée par une subvention du National Institutes of Health, National Institute of Dental and Craniofacial Research (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referencias
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
