Een methode voor het meten van speekselklier functie in muizen
Summary
Speekselklier hypofunction is een frequente gevolg van auto-immune ziekte en straling therapie. Reproduceerbaar evaluatie van speekselklier functie in muismodellen van deze ziekten is een technische uitdaging. Hier wordt een eenvoudige methode voor nauwkeurige en reproduceerbare meting van speeksel productie in muizen beschreven.
Abstract
Patiënten met het syndroom van Sjögren, een auto-immune ziekte die de exocrine klieren, ontsteking van de speekselklier ontwikkelen en speeksel productie is gedaald. Ook is speeksel productie ernstig aangetast in patiënten die radiotherapie voor kanker van het hoofd en de nek. Knaagdier modellen, ontwikkeld om deze klinische omstandigheden, nabootsen vergemakkelijken van een goed begrip van de pathogenese van de ziekte en toestaan voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën. Daarom is de mogelijkheid om nauwkeurig, reproducibly en herhaaldelijk meten speekselklier functie in diermodellen is kritisch. Voortbouwend op de procedures die zijn beschreven in de literatuur, een methode ontwikkeld die aan deze criteria voldoet en werd gebruikt om de functie van de speekselklier bij muizen wordt geëvalueerd. Een bijkomend voordeel van deze nieuwe methode is dat het is gemakkelijk onder de knie, en weinig variatie tussen exploitant heeft. Speekselklier functie wordt geëvalueerd als de hoeveelheid (gewicht of volume) of een percentage (mL/min) speeksel in reactie op pilocarpine stimulatie geproduceerd. De verzamelde speeksel is een goede bron voor de analyses van het gehalte aan andere melkeiwitten, immunoglobulin concentraties en andere biomoleculen.
Introduction
De speekselklieren produceren speeksel in reactie op een verscheidenheid van neurologische en mechanische stimuli1. De prikkels zijn uitgevoerd door het sympathische en parasympathische zenuwstelsel aan de adrenergic en cholinerge receptoren in de klier. Pilocarpine is een cholinerge, para-sympathomimetic agent die voornamelijk op muscarinerge receptoren fungeert. In de speekselklier induceert het de productie van speeksel door te handelen op de muscarinerge acetylcholine receptor M31. Productie van speeksel na toediening van de pilocarpine is een indicator van het vermogen van de speekselklieren te reageren op de stimulatie en wordt vaak gebruikt als een maatregel van speekselklier functie.
Nauwkeurige meting van het speeksel productie is van cruciaal belang in de studie van speekselklier ziekten met inbegrip van Sjögren syndroom2 en straling schade na van hoofd en nek kanker behandeling3. Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het meten van de productie van speeksel in knaagdieren. Deze omvatten directe cannulation van het uitscheidingsmechanisme speeksel buis4, de collectie van speeksel uit de mondholte onder vacuüm5en collectie glazen capillairen6 of een micropipet7,–8, 9. directe cannulation van het speeksel kanaal biedt de meest nauwkeurige en zuiver speeksel. Echter, dit is een technisch uitdagende procedure, en het potentieel voor het veroorzaken van letsel ductaal uitsluit repetitieve speeksel collecties van hetzelfde dier. Het verzamelen van speeksel onder vacuüm kan leiden tot variabele resultaten te wijten aan het drogen van het speeksel uit de buis. Dit verlies is verder overdreven in muizen met verminderde speekselvloed. Glazen capillairen toe de collectie van speeksel voor latere analyses, veranderingen in de viscositeit van het speeksel uitgescheiden in de zieke staat voorkomt echter dat efficiënte vulling van het capillair. Verder kunnen probeert te vegen de mondholte voor het verzamelen van de resterende speeksel leiden tot letsel. De pipet-methode zorgt voor de complete collectie, en voor dezelfde exploitant, het is opmerkelijk consistente tussen experimenten. Om onbekende redenen blijkt deze methode echter aanzienlijke variatie tussen de verschillende exploitanten. Zodat passende vergelijkingen, wordt het daarom noodzakelijk dat dezelfde exploitant alle experimenten gerelateerd aan een specifiek project voert. Duidelijk, vertegenwoordigt dit een groot nadeel voor een laboratorium.
Om te overwinnen van deze problemen, werd een procedure uitgewerkt dat combineert speeksel vergaringsmethoden voor mens en knaagdieren gebruikt. De swab-methode, beschreven hieronder voor het meten van speeksel pilocarpine-geïnduceerde volume is eenvoudig, reproduceerbaar is, niet beïnvloed door de exploitant, en herhaaldelijk kan worden uitgevoerd in hetzelfde dier. Verder staat het verzamelen van het speeksel voor latere analyses van eiwitten, immunoglobulinen, of andere biomoleculen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Speeksel productie is een complex proces en wordt beïnvloed door vele factoren. Meten van speekselklier functie in laboratoriumdieren kan dus een uitdaging. Een extra uitdaging is dat herhaalde metingen van speekselklier functie in hetzelfde dier nodig om de eerste verschijnselen van ziekte of om aan te tonen van herstel na de behandeling zijn.
De in dit verslag beschreven methode van doekje is technisch eenvoudig uit te voeren met meerdere opties zodat de gegevens vertegenwoordigen. De resul…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health, National Institute van tand- en craniofaciale onderzoek (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referencias
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
