Een Microbiomechanical systeem voor het bestuderen van de vorming van de Varicosity en herstel in Midden Neuron axonen

De vorming van de varicosity, of zwelling/beading, langs de axonen, is een opvallend kenmerk van neurodegeneratie waargenomen bij veel aandoeningen of verwondingen van het centrale zenuwstelsel, zoals multiple sclerose, ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en traumatische hersenen letsel^1,2. Ondanks de significante fysiologische effecten van axonale varicosities over actiepotentiaal propagatie en synaptische transmissie³is het onbekend hoe de varicosities worden gegenereerd. Onlangs, een nieuw opgerichte microbiomechanical assay op gekweekte hippocampal neuronen van knaagdieren gebruikt, we vonden dat een mechanische stimuli varicosities in deze neuronen met zeer intrigerende functies kunnen veroorzaken. Ten eerste, varicosity-inductie is snelle (< 10 s) en dit proces is onverwacht omkeerbaar. Ten tweede, de afhankelijk van de varicosity Inleiding sterkte puffend druk: hoe hoger de druk, hoe sneller de opening. Ten derde hangt varicosity initiatie in neuronale leeftijd. De axonen van jongere neuronen lijken ontvankelijker voor mechanische stress, vergeleken met die van oudere neuronen. Ten vierde, de vorm van de varicosities langs de axonen van hippocampal neuronen, terwijl de dendrites en eerste axon segmenten van deze neuronen geen verandering onder dezelfde puffende voorwaarde weergeven Onze studie bleek dus, een nieuwe functie van neuronale polariteit. Deze bevindingen met de in vitro -systeem zijn fysiologisch relevant. Met behulp van een in vivo -model voor licht traumatisch hersenletsel (mTBI), toonden we dat axonale varicosities ontwikkeld in een multi focale mode in de Somatosensorische cortex van de muizen onmiddellijk na sluiten-schedel impact, conform onze in vitro resultaten⁴. Het is belangrijk op te merken dat onze kleuring en beeldvorming van de mTBI muizen bieden slechts een onverwacht schot van neuronale morfologische veranderingen, sinds het uitvoeren van in vivo time-lapse beeldvorming van neuronale morfologie tijdens een mechanische impact is nog niet haalbaar.

Dit systeem van vloeistof-puffend konden we niet alleen unieke functies die zijn gekoppeld aan mechanische stress-geïnduceerde varicosity vorming, maar ook om te bepalen van het onderliggende mechanisme. Door het testen van verschillende extracellulaire oplossingen, de blokkers en openers van verschillende kandidaten van mechanosensitive ionenkanalen, en cellulaire electrofysiologie, vastgesteld wij dat de potentiële catie van voorbijgaande receptor kanaal onderfamilie V lid 4 (TRPV4) kanaal dat is luchtdoorlatend Ca^{2 +} en nb⁺ en geactiveerd door puffend is voornamelijk verantwoordelijk voor het opsporen van de eerste mechanische spanning tijdens axonale varicosity formatie⁴. Dit wordt verder bevestigd met een knock-out-benadering van siRNA. Samen genomen, dit nieuwe systeem van de test die hebben we ontwikkeld met hippocampal neuron cultuur, is zeer waardevol voor het bestuderen van de eigenschappen van de micromechanische van centrale neuronen, vooral in combinatie met andere technieken.

Dit micromechanische systeem dat wij hebben opgebouwd is uniek en verschilt van de eerder bestaande systemen in verschillende belangrijke aspecten. Eerst, ervaar de neuronen in dit systeem, uit-van-plane mechanische stress in de vorm van compressie en afschuiving. Tijdens de botsing zijn mechanische neuronale processen blijven gehecht aan het dekglaasje aan oppervlak en niet verplaatst. Dit verschilt van andere experimentele systemen die voornamelijk buigen en strekken van in-plane (of spanning), bijvoorbeeld, de uitwijking van gebundelde axonen als tekenreeksen^5,6 verplaatsen of strekken axonen geteeld op micropatterned kanalen en rekbare membranen^7,8. Bovendien, hoewel axonale varicosities kunnen ook worden opgewekt deze testen zoals in ons systeem van vloeistof-puffend, het proces in deze instellingen veel langer duurt (vanaf 10 min op verschillende uren^6,–^7,8) en verschijnt onomkeerbaar. Ten slotte, ons systeem met behulp van lokale vloeistof puffend staat het onderzoek van de ruimtelijke kenmerken van varicosity formatie (bv., dendrites, dendritische spines, soma, axonale eerste segmenten, axonale terminals), naast de tijdelijke functies. Met behulp van dit systeem, ontdekten we verschillende onverwachte en unieke functies van axonale varicosity formatie, vooral snelle begin traag reversibele en axon-dendriet polariteit.

Het systeem dat we in dit papier bespreken is compatibel met vele technieken voor moleculaire en celbiologie. Bijvoorbeeld, om te bestuderen van de gevolgen van mechanische belasting voor neuronale morfologie en functie, kan het worden gebruikt samen met myeline coculture, time-lapse imaging van fluorescerende resonantie energieoverdracht (FRET) en de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF), calcium beeldvorming, en patch klem opname. In dit document richten we ons op de belangrijkste onderdelen van het systeem. Hippocampal neuron cultuur, de vloeistof-puffend setup, high-resolution time-lapse imaging voor axonale vervoer en calcium imaging worden stapsgewijze hieronder geïllustreerd.