تضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة للتحليل المجهري
Summary
يصف لنا التثبيت وتضمين البارافين وتقنيات تقطيع رقيقة للأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. في إعداد العينات، يمكن تصور أنماط التعبير محيطة ومراسل بيوفيلم بالفحص المجهري.
Abstract
تقطيع عن طريق تضمين البارافين أسلوب المنشأة على نطاق واسع في نظم حقيقية النواة. هنا نقدم طريقة لتثبيت البرنامج، التضمين، وتمزيقها للأغشية الحيوية سليمة مستعمرة الميكروبية باستخدام شمع البارافين perfused. للتكيف مع هذا الأسلوب للاستخدام في مستعمرة الأغشية الحيوية، تطوير تقنيات للحفاظ على كل عينة على الركيزة النمو وتغليف شفاف فإنه مع أوفيرلايير أجار، وإضافة يسين للحل مثبت. هذه التحسينات تحسين الاحتفاظ بعينه والحفاظ على ميزات ميكرومورفولوجيكال. نماذج إعداد بهذه الطريقة قابلة رقيقة تمزيقها والتصوير بالمجهر الإلكتروني الضوء، والأسفار، وانتقال العدوى. نحن طبقت هذه التقنية على مستعمرة الأغشية الحيوية الزائفة الزّنجاريّةPseudomonas سينكسانثا ونجحت عصية، و الكوليرا. ارتفاع مستوى التفاصيل التي تظهر في العينات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع مراسل سلالة الهندسة أو استخدام الأصباغ محددة، يمكن أن توفر أفكاراً مثيرة في علم وظائف الأعضاء وتنمية المجتمعات الميكروبية.
Introduction
معظم الميكروبات لها القدرة على شكل الأغشية الحيوية، الذي عقد مجتمعات خلايا معا بالذات المنتجة المصفوفات. الأغشية الحيوية يمكن زراعتها في أنواع عديدة من الأجهزة المادية، مع مختلف النظم لتوفير المواد الغذائية والركيزة. فحوصات محددة لتشكيل بيوفيلم تميل إلى أن تسفر عن هياكل متعددة الخلايا استنساخه، وملاحظة أبنية مشتركة بالنسبة للأنواع المتنوعة فيلوجينيتيكالي على المجتمع أو على مستوى العيانية. عندما تزرع الميكروبات كمستعمرات في المتوسطة الصلبة تحت جو، ينقل المعلومات حول القدرة على إنتاج مصفوفة مورفولوجيا العيانية وكثيراً ما يرتبط مع سائر الصفات 1،2،3. البنية الداخلية للمستعمرات الميكروبية يمكن أيضا أن توفر أدلة بخصوص بيوفيلم-خاصة بالكيمياء وعلم وظائف الأعضاء، ولكن كان من الصعب تميز. تمكين التطبيقات الحديثة لتقنيات كريومبيدينج وكريوسيكتيونينج للمستعمرات البكتيرية التصوير والتصور من السمات المحددة في قرار لم يسبق له مثيل 4،،من56. ومع ذلك، أظهرت الدراسات مع الأنسجة الحيوانية أن التضمين البارافين يوفر الحفاظ على تفوق مورفولوجيا بالمقارنة مع كريومبيدينج 7 ، وقد استخدمت لتصور البكتيريا في أنسجة 8،9. ولذلك قمنا بتطوير بروتوكول للتثبيت، وتضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. وهنا، نحن سوف تصف إعداد الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 بيوفيلم مستعمرة مقاطع رقيقة 10،11، ولكن نحن أيضا بنجاح تطبيق هذا الأسلوب للأغشية الحيوية التي شكلتها البكتيريا سينكسانثا pseudomonas، ونجحت عصية، و الكوليرا12.
تتبع عملية التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة الأغشية الحيوية منطق بسيط. أولاً، يتم المغطى الأغشية الحيوية في طبقة من أجار للحفاظ على مورفولوجيا أثناء المعالجة. ثانيا، المغطى-الأغشية الحيوية مغمورة في مثبت للجزيئات التشعب والحفاظ على ميكرومورفولوجي. هذه هي المجففة ثم مع الكحول، وتطهيرها بالمذيبات غير قطبية أكثر، وثم تسللت مع شمع البارافين السائل. مجرد تسلل، يتم تضمين العينات إلى كتل الشمع لتمزيقها. قطع المقاطع، شنت على الشرائح، وثم امهاء بغية إعادتها إلى دولة أصلية أكثر. من هذه النقطة، يمكن الملون أو المشمولة في وسط تصاعد للتحليل المجهري.
وينتج هذا البروتوكول مقاطع رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مناسبة للتحليل النسيجي. مستعمرة بيوفيلم هياكل فرعية مرئية عندما يتم تصويرها رقيقة أقسام المعدة باستخدام هذا الأسلوب بالفحص المجهري الخفيفة. الأغشية الحيوية يمكن أيضا نمت على البقع الفلورسنت التي تحتوي على وسائط محددة للسمات الفردية أو الملون في خطوة الإماهة، مباشرة قبل تصاعد (خطوات 9.5-9.6). وأخيراً، يمكن إجراء هندسة عكسية الميكروبات لإنتاج البروتينات الفلورية بطريقة التأسيسي أو التنظيم مما يسمح في الموقع إبلاغ الخلية التعبير التوزيع أو الجينات داخل هذه المجتمعات. وقد استخدمنا هذه الأساليب لتحديد عمق بيوفيلم مستعمرة وتوزيع الخلايا وتوزيع مصفوفة، وأنماط النمو والتعبير الجيني الزمانية المكانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عينات الأنسجة التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة هو أسلوب النسيجي كلاسيكية التي يمكن تصوير هياكل المورفولوجية الدقيقة ويستخدم عادة على أنسجة حقيقية النواة، وقد طبقت بنجاح بعض العينات الجرثومية8 ،9. بينما كريومبيدينج يسمح للقوى الاحتفاظ بإشارة الذاتية وإي?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل NSF الوظيفي جائزة 1553023 وجائزة المعاهد الوطنية للصحة/نييد R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
Referencias
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
