Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique
Summary
Nous décrivons la fixation, enrobage de paraffine et des techniques de sectionnement minces pour les biofilms de colonies microbiennes. Dans les échantillons préparés, patrons de biofilm sous-structure et reporter d’expression peuvent être visualisées par microscopie.
Abstract
Sectionnement par enrobage de paraffine est une technique largement établie aux systèmes eucaryotes. Ici, nous fournissons une méthode pour la fixation, enrobage et sectionnant des biofilms de colonies microbiennes intact à l’aide de cire de paraffine perfusée. Pour adapter cette méthode pour une utilisation sur les biofilms de colonie, nous ont développé des techniques pour maintenir chaque échantillon sur son substrat de croissance et il laminage avec une surcouche d’agar et lysine a ajouté à la solution de fixation. Ces optimisations améliorent la conservation d’échantillons et de la préservation des caractéristiques micromorphologiques. Les échantillons préparés de cette manière sont prêtent pour fluidifier le sectionnement et imagerie par microscopie photonique, fluorescence et. Nous avons appliqué cette technique à la colonie des biofilms de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtiliset Vibrio cholerae. Le haut niveau de détail visible dans les échantillons générés par cette méthode, combinée avec la souche journaliste génie ou l’utilisation des colorants spécifiques, peuvent fournir un aperçu passionnant de la physiologie et le développement des communautés microbiennes.
Introduction
La plupart des microbes ont la capacité de forme biofilms, communautés de cellules attachées par des matrices auto-produit. Biofilms peut être cultivés dans de nombreux types de configurations physiques, avec différents régimes de disposition des éléments nutritifs et le substrat. Des tests spécifiques pour la formation de biofilm ont tendance à produire des structures multicellulaires reproductibles et architectures courantes sont observées pour des espèces phylogénétiquement diversifiés au niveau macroscopique ou communauté. Lorsque les microbes sont cultivés comme colonies sur milieu solide sous une atmosphère, morphologie macroscopique fournit des informations sur la capacité de production de la matrice et souvent en corrélation avec les autres traits 1,2,3. L’architecture interne des colonies microbiennes peut également fournir des indices sur le biofilm spécifique chimie et physiologie, mais il a été difficile à caractériser. Les applications récentes de techniques Cryoinclusion et cryosectioning aux colonies bactériennes ont permis d’imagerie et de visualisation des caractéristiques spécifiques à une résolution sans précédent de5, 4,6. Cependant, avec les tissus d’origine animale ont démontré que paraffine incorporation prévoit la conservation supérieure de morphologie comparée à Cryoinclusion 7 et a été utilisée pour visualiser des bactéries dans les tissus 8,9. Nous avons donc mis au point un protocole pour la fixation, enrobage de paraffine et découpe fine des colonies microbiennes biofilms. Ici, nous allons décrire la préparation de Pseudomonas aeruginosa PA14 colonie-biofilm minces 10,11, mais nous avons également avec succès appliqué cette technique aux biofilms formés par les bactéries Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, et Vibrio cholerae12.
Le processus d’enrobage de paraffine et de coupes minces biofilms suit une logique simple. Tout d’abord, les biofilms sont entourées d’une couche de gélose pour préserver la morphologie au cours du traitement. Deuxièmement, les biofilms enfermé sont submergées dans un fixateur aux macromolécules crosslink et préserver la micromorphologie. Ceux-ci sont ensuite déshydratés avec de l’alcool, effacés avec un solvant non polaire plus et puis infiltrés avec de la cire de paraffine liquide. Une fois infiltré, les échantillons sont intégrés dans des blocs de cire pour le sectionnement. Sections sont coupées, montées sur des glissières et puis réhydratées afin de retourner à un État plus naturel. De ce point, peut être teintés ou traitées dans le milieu de montage pour analyse microscopique.
Ce protocole produit des coupes minces des biofilms microbiens d’analyse histologique. Sous-structures de biofilm de colonie sont visibles lors de coupes minces préparées à l’aide de cette méthode sont imagés au microscope photonique. Biofilms également peuvent être cultivées sur des taches fluorescentes contenant de médias spécifiques pour les fonctions individuelles ou teintés à la phase de réhydratation, immédiatement avant le montage (étapes 9,5-9,6). Enfin, les microbes peuvent être conçues pour produire des protéines fluorescentes de manière constitutive ou réglementé permettant in situ rapports d’expression de distribution ou un gène cellulaire au sein de ces communautés. Nous avons utilisé ces méthodes pour déterminer la profondeur de biofilm de colonie, distribution cellulaire, distribution de matrice, profils de croissance et expression génique spatio-temporelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des échantillons de tissus enrobage de paraffine et de coupes minces est une technique histologique classique qui permet l’imagerie des structures micro-morphologiques et est couramment utilisée sur les tissus eucaryotes et a été appliquée avec succès aux échantillons microbiens8 ,,9. Cryoinclusion permet à forte rétention de signal endogène et par immunofluorescence, enrobage de paraffine est généralement préférable car il fournit la meilleure p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la NSF carrière prix 1553023 et NIH/NIAID prix R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
Referencias
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