Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide
Summary
Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell’analisi genetica.
Abstract
Semplice sequenza ripetere (SSR) è uno degli indicatori più efficaci utilizzati in programmi di allevamento molecolare e ricerca genetica vegetale e animale. Macchiatura d’argento è un metodo ampiamente usato per l’individuazione di marcatori SSR in un gel di poliacrilammide. Tuttavia, protocolli convenzionali per la macchiatura d’argento sono tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Come molti altri laboratorio biologico tecniche, argento che macchia i protocolli sono stati costantemente ottimizzati per migliorare l’efficienza di rivelazione. Qui, segnaliamo un semplificato argento che macchia il metodo che significativamente riduce i costi di reagente e migliora la chiarezza di rilevamento ad alta risoluzione e foto. Il nuovo metodo richiede due passaggi principali (impregnazione e sviluppo) e tre reagenti (nitrato d’argento, idrossido di sodio e formaldeide) e solo 7 min di elaborazione per un non-denaturante del gel di poliacrilammide. Rispetto ai protocolli precedentemente segnalati, questo nuovo metodo è più facile, più veloce e utilizza meno reagenti chimici per il rilevamento di SSR. Pertanto, questo argento semplice, basso costo ed efficace protocollo di colorazione trarranno beneficio mappatura genetica e riproduzione assistita da una rapida generazione di dati marcatore SSR.
Introduction
Lo sviluppo di marcatori basati sulla PCR ha rivoluzionato la scienza della genetica vegetale e allevamento1. Indicatori di sequenza semplice ripetizione (SSR) sono tra i marcatori di DNA più versatili e più comunemente utilizzati. Loro genoma ampia copertura, abbondanza, specificità del genoma e ripetibilità sono solo alcuni dei meriti di marcatori SSR oltre alla loro eredità codominante per l’individuazione di genotipi eterozigoti2. Parecchi studi hanno utilizzato i marcatori SSR per indagare la diversità genetica, tenere traccia di ascendenza, costruire mappe di collegamento genetico e mappare geni per tratti economicamente importanti3,4.
I prodotti di PCR di marcatori SSR comunemente sono separati mediante elettroforesi dell’agarosi o gel di poliacrilammide e poi visualizzati con la macchiatura d’argento o sotto luce UV dopo colorazione con bromuro di etidio. Macchiatura d’argento di frammenti di DNA in gel di poliacrilammide è più sensibile rispetto al altri colorazione metodi5,6 ed è stato ampiamente utilizzata per rilevare i frammenti di DNA ad esempio SSR marcatori7.
Come molte tecniche di laboratorio biologico, macchiatura d’argento del gel di poliacrilammide è costantemente migliorato dal suo primo segnalato come una tecnica di visualizzazione frammento nel 19798. La tecnica è stata inizialmente modificata per il rilevamento dei frammenti del DNA da Bassam et al. 6 nel 1991 e poi migliorato da Sanguinetti e colleghe9 nel 1994. Il metodo è stato ulteriormente ottimizzato nelle ultime pochi decenni6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Tuttavia, la maggior parte di queste versioni aggiornate dei protocolli hanno ancora alcuni svantaggi, come alta richiesta tecnica e lungo tempo per la fissazione di elaborazione e montaggio6, che limitano l’applicazione di questi protocolli7, 11. Un protocollo ottimale che combina basso costo ad alta efficienza di rilevazione del frammento del DNA è urgente per applicazioni di routine d’argento che macchia nella ricerca biologica.
Inoltre, gel di poliacrilammide può essere diviso in gel di poliacrilammide denaturante e non-denaturante, ed entrambi possono essere utilizzati per l’individuazione di marcatori SSR usando l’argento che macchia il metodo. L’effetto e la risoluzione delle quali non differiscono significativamente, ma non-denaturante del gel di poliacrilammide sono più facile da processo e prendere meno tempo16.
Sulla base della precedente ricerca15, lo scopo di questo studio è di descrivere un argento ottimizzato protocollo dettagliatamente per rilevazione veloce, facile e basso costo di SSR markers in un non-denaturante del gel di poliacrilammide di colorazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il lavaggio del gel dopo l’impregnazione è un passaggio fondamentale. Volume di tempo e acqua di lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta di impregnazione soluzione sulla superficie della piastra e il gel e causare uno sfondo scuro. Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passaggio chiave, eccesso di sviluppo può risultare in una priorità bassa scura con immagine a basso contrasto dei frammenti del DNA. Inoltre, il passaggio di impregnazione influenza in modo significativo l’efficienza colorazi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato il Natural Science Foundation di Guangdong (2015A030313500), la piattaforma di ricerca di Key International Cooperative provinciali e i principali scientifico ricerca progetto di Guangdong istruzione superiore (2015KGJHZ015), la scienza e Piano per le tecnologie di Guangdong amministrazione del monopolio del tabacco (201403, 201705), la scienza e la tecnologia piano di Guangdong, Cina (2016B020201001), il progetto di formazione nazionale di innovazione per gli studenti (201711078001). Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Ministero dell’agricoltura. USDA è un fornitore di pari opportunità e il datore di lavoro.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referencias
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