سريع الفضة تلطيخ البروتوكول تمكين بسيطة والكشف عن كفاءة من علامات الاشتراكية السوفياتية باستخدام هلام Polyacrylamide يشوه عدم
Summary
هنا، نحن تقرير فضية بسيطة ومنخفضة التكلفة تلطيخ البروتوكول الذي يتطلب سوى ثلاثة من الكواشف ودقيقة 7 من تجهيز، وهو مناسبة لتوليد سريعة عالية الجودة الاشتراكية السوفياتية البيانات في التحليل الجيني.
Abstract
تكرار تسلسل بسيط (SSR) واحد من العلامات الأكثر فعالية استخدامها في البحوث الجينية النباتية والحيوانية وبرامج التربية الجزيئية. تلوين الفضة أسلوب مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية في جل بولياكريلاميدي. ومع ذلك، البروتوكولات التقليدية لتلطيخ الفضية من الناحية التقنية شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. مثل العديد من المختبرات البيولوجية الأخرى تم التقنيات، والفضة تلطيخ البروتوكولات اطراد الأمثل لتحسين كفاءة الكشف. هنا، نحن تقرير فضية مبسطة تلطيخ الأسلوب الذي يقلل تكاليف الكاشف إلى حد كبير ويعزز وضوح القرار وصورة كشف. يتطلب الأسلوب الجديد الكواشف الثلاثة (نترات الفضة, هيدروكسيد الصوديوم وفورمالدهايد)، خطوتين رئيسيتين (التشريب والتنمية) وفقط 7 دقائق لتجهيز لجل polyacrylamide غير يشوه. بالمقارنة مع بروتوكولات سبق الإبلاغ عنها، هذا الأسلوب الجديد هو أسهل وأسرع ويستخدم أقل من الكواشف الكيميائية للكشف عن إصلاح قطاع الأمن. ولذلك، سيستفيد هذا فضية بسيطة ومنخفضة التكلفة وفعالة تلطيخ البروتوكول بمساعدة الواسمات تربية قبل جيل سريعة لإصلاح قطاع الأمن علامة البيانات ورسم الخرائط الجينية.
Introduction
وضع علامات على أساس بكر قد أحدث ثورة في علم الوراثة النباتية وتربية1. ومن علامات (SSR) تكرار تسلسل بسيط بين علامات الحمض النووي الأكثر شيوعاً والأكثر تنوعاً. تغطية الجينوم واسعة ووفرة وخصوصية الجينوم، والتكرار بعض الأسس الموضوعية لعلامات الاشتراكية السوفياتية بالإضافة إلى الإرث كودومينانت للكشف عن الأنماط الجينية متخالف2. واستخدمت عدة دراسات علامات الاشتراكية السوفياتية للتحقيق في التنوع الوراثي وتتبع النسب وبناء خرائط الربط الجينية ورسم خريطة للجينات للسمات الهامة اقتصاديا3،4.
يتم فصل منتجات PCR علامات الاشتراكية السوفياتية يشيع استخدام التفريد [اغروس] أو هلام polyacrylamide وتصور مع تلطيخ الفضة أو تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ثم بعد تلطيخ مع اثيديوم بروميد. تلوين الفضة لشظايا من الحمض النووي في الهلام بولياكريلاميدي هو أكثر حساسية من غيرها المصبوغة أساليب5،6 وقد استخدمت على نطاق واسع للكشف عن شظايا من الحمض النووي مثل الاشتراكية السوفياتية علامات7.
مثل العديد من تقنيات المختبرات البيولوجية، تلطيخ الفضة من المواد الهلامية polyacrylamide تحسنا مطردا منذ، أولاً يتم الإبلاغ عنها كأسلوب تصور يفتت في 19798. التقنية تعديل في البداية للكشف عن شظايا من الحمض النووي من قبل بسام et al. 6 وفي عام 1991 وتحسنت ثم سانغينتي وزملاء العمل9 في عام 1994. وقد تم تحسين الأسلوب كذلك في الماضي بضعة عقود6،7،9،10،11،12،13،14 , 15-ومع ذلك، معظم هذه الإصدارات المحدثة من البروتوكولات لا تزال لديها بعض العيوب مثل ارتفاع الطلب التقنية وطويلة تجهيز الوقت للتثبيت وتركيب6، التي تحد من تطبيق هذه البروتوكولات7، 11. وضع بروتوكول أمثل الذي يجمع بين منخفضة التكلفة بكفاءة عالية من الحمض النووي جزء الكشف عن حاجة ملحة للتطبيق الروتيني للفضة تلطيخ في الأبحاث البيولوجية.
وباﻹضافة إلى ذلك، جل polyacrylamide يمكن تقسيم المواد الهلامية polyacrylamide يشوه وغير يشوه، وكلاهما يمكن استخدامها للكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية استخدام الفضة تلطيخ الأسلوب. التأثير والقرار التي لا تختلف كثيرا، ولكن غير يشوه الهلام polyacrylamide هي أسهل للعملية وتأخذ أقل وقت16.
استناداً إلى البحوث السابقة15، هدف الدراسة الحالية لوصف فضة أمثل تلطيخ البروتوكول بالتفصيل للكشف عن علامات الاشتراكية السوفياتية في جل polyacrylamide غير يشوه سريعة وسهلة ومنخفضة التكاليف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الغسيل جل بعد التلقيح خطوة حاسمة. حجم الغسيل عدم كفاية الوقت والمياه قد تتسبب إزالة الحل التشريب ناقصة على سطح اللوحة والهلام، ويؤدي إلى خلفية داكنة. النامية الوقت المناسب خطوة رئيسية أخرى، يمكن أن يؤدي تطوير الإفراط في خلفية بني داكن مع الصورة التباين المنخفض من شظايا من الحمض النووي. وب?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بمؤسسة العلوم الطبيعية قوانغدونغ في الصين (2015A030313500) والمقاطعات الرئيسية التعاونية أبحاث منهاج العمل الدولي للرئيسية العلمية البحوث مشروع قوانغدونغ التعليم العالي (2015KGJHZ015)، العلم و خطة تكنولوجيا إدارة قوانغدونغ احتكار التبغ (201403، 201705) والعلوم والتكنولوجيا خطة قوانغدونغ الصين (2016B020201001)، مشروع التدريب الوطنية للابتكار لطلاب المرحلة الجامعية (201711078001). الإشارة إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل “وزارة الزراعة الأمريكية”. وزارة الزراعة هو موفر تكافؤ الفرص ورب العمل.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referencias
- Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).
