Kemiska Amputation och förnyelse i svalget i Planarian Schmidtea mediterranea
Summary
Planarian Schmidtea mediterranea är en utmärkt modell för att studera stamceller och vävnadsregeneration. Denna publikation beskriver en metod för att selektivt avlägsna ett organ, svalget, genom att utsätta djur för att de kemiska natriumazid. Detta protokoll beskrivs också metoder för övervakning av svalget regenerering.
Abstract
Planarians är plattmaskar som är extremt effektiva på förnyelse. De är skyldiga denna förmåga att ett stort antal stamceller som kan svara snabbt på någon typ av skada. Gemensamma skada modeller i dessa djur ta bort stora mängder vävnad, som skadar flera organ. För att övervinna denna breda vävnadsskada, beskriver vi här en metod för att selektivt ta bort ett enda organ, svalget, i planarian Schmidtea mediterranea. Detta uppnår vi genom blötläggning djur en lösning innehållande cytokrom oxidas hämmare natriumazid. Kort exponering för natriumazid orsakar extrudering i svalget från djuret, som vi kallar ”kemiska amputation”. Kemiska amputation tar bort hela svalget och genererar ett litet sår där svalget fäster tarmen. Efter omfattande sköljning, regenerera alla amputerade djur en fullt fungerande svalget i ungefär en vecka. Stamceller i resten av kroppen kör regenerering av nya svalget. Här, vi ger en detaljerad protokoll för kemiska amputation och beskriva både histologiska och beteendevetenskapliga metoder för att bedöma framgångsrika amputation och förnyelse.
Introduction
Förnyelse är ett fenomen som uppstår i hela djurriket, med regenerativ kapacitet från hela kroppen förnyelse i vissa ryggradslösa djur till mer begränsade förmågor i ryggradsdjur1. Byte av funktionella vävnader är en komplex process och ofta innebär samtidig återställandet av flera celltyper. Till exempel att regenerera den salamander lem, osteoblaster, kondrocyter, nervceller, muskler och epitelceller behöver vara ersatt2. Dessa nyligen genererade celltyper behöver också organiseras korrekt att underlätta nya lem funktion. Förstå dessa komplexa processer kräver tekniker som fokuserar på förnyelse av specifika celltyper och deras integrering i organ.
En av de strategier som används för att förenkla studiet av regenerativ svaren är riktade ablation av antingen vissa celltyper eller större samlingar av vävnader. Till exempel i zebrafiskar leder uttryck för nitroreductase i specifika celltyper till deras förstörelse efter applicering av metronidazol3,4. I Drosophila larver, kan uttrycker pro-apoptotiska generna under vävnadsspecifika initiativtagare selektivt avlägsna specifika regioner av imaginal skiva5,6. Båda dessa strategier snabb men kontrollerade skada, och har använts för att dissekera de molekylära och cellulära mekanismerna som ansvarar för regenerering.
I detta manuskript beskriver vi en metod för att selektivt avlägsna hela organ kallas svalget i planarian Schmidtea mediterranea. Planarians är en klassisk modell av förnyelse, kända för sin produktiva regenerativ förmåga, där även minuten fragment kan återföds hela djur 7,8. De har en stor, heterogen befolkning av stamceller som består av både pluripotenta celler och härstamning-begränsad föräldraparets9,10,11. Dessa celler föröka sig och differentiera för att ersätta alla saknade vävnader, inklusive svalget, nervös-, mag- och utsöndringsorganen system och muskel och epitelceller9,10,12. Även om vi vet att dessa stamceller initiera regenerering, förstår vi inte fullt ut de molekylära mekanismer som driver dem att ersätta alla dessa olika celltyper. Definierade skadade metoder att framkallar exakt stamceller Svaren kan hjälpa till att avgränsa denna komplicerade process.
Svalget är ett stort, cylindriska rör som krävs för utfodring och innehåller nervceller, muskler, epitelial och sekretoriska celler13,29. Normalt dold i en påse på ventrala sida av djuret, det sträcker sig genom djurets enda kropp öppning vid avkänning förekomsten av mat. För att selektivt amputera svalget, Blötlägg vi planarians i en kemisk kallas natriumazid, en vanliga bedövningsmedel i C. elegans14,15,16. Dess användning i planarians rapporterades först av Adler et al., i 201412. Inom minuter efter exponering för natriumazid, planarians pressa deras pharynges, och med mild agitation, svalget lossnar från djuret. Vi kallar denna kompletta och selektiv förlust i svalget ”kemiska amputation”. En vecka efter amputation, är en fullt fungerande svalget återställda12. Eftersom svalget krävs för utfodring, kan funktionell förnyelse mätas genom att övervaka utfodring beteende. Vi beskriver nedan, protokollet för kemiska amputation och för bedömningen av regenerering av svalget och restaurering av utfodring beteende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver en metod för selektiv ablation av svalget med natriumazid. Andra riktade ablation studier i planarians har använt modifierade operation ta bort fotoreceptorer21 eller farmakologisk behandling att ablatera dopaminerga nervceller22. En betydande fördel med kemiska amputation över befintliga metoder är att det inte kräver kirurgi. Svalget jämfört med resten av planarian kroppen styv struktur underlättar dess avlägsnande från djuret, vi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Alejandro Sánchez Alvarado, som stödde det ursprungliga optimering och utveckling av denna teknik. Arbete i Carolyn Adlers laboratorium stöds av Cornell University nystartade fonder.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
Referencias
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
