Amputation chimique et la régénération du Pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea
Summary
La planaire Schmidtea mediterranea est un excellent modèle pour l’étude des cellules souches et la régénération des tissus. Cette publication décrit une méthode pour éliminer sélectivement un organe, le pharynx, en exposant les animaux à l’azoture de sodium chimique. Ce protocole décrit également les méthodes de suivi de la régénération du pharynx.
Abstract
Platyhelminthes sont vers plats qui sont extrêmement efficaces à la régénération. Ils doivent cette capacité à un grand nombre de cellules souches qui peuvent répondre rapidement à tout type de blessure. Modèles de lésion commune chez ces animaux retirer de grandes quantités de tissus, qui endommage plusieurs organes. Pour surmonter ces dommages de tissu large, nous décrivons ici une méthode pour supprimer sélectivement un organe unique, le pharynx, dans le planaire Schmidtea mediterranea. Nous y parviendrons par des animaux trempage dans une solution contenant de l’azide de sodium inhibiteur du cytochrome oxydase. Une exposition brève à l’azoture de sodium provoque extrusion du pharynx de l’animal, que nous appelons « amputation chimique. » Amputation chimique supprime le pharynx entier et génère une petite plaie où le pharynx s’attache à l’intestin. Après le rinçage approfondie, amputé de tous les animaux régénèrent un pharynx entièrement fonctionnel dans environ une semaine. Régénération du pharynx nouvelle en voiture des cellules souches dans le reste du corps. Ici, nous fournissons un détaillé protocole d’amputation chimique et décrire les méthodes histologiques et comportementales pour évaluer l’amputation réussie et la régénération.
Introduction
La régénération est un phénomène qui se produit dans tout le règne animal, avec une capacité régénératrice de régénération du corps entier à certains invertébrés aux capacités plus restreintes dans les vertébrés1. Remplacement des tissus fonctionnels est un processus complexe et implique souvent la restauration simultanée de plusieurs types de cellules. Par exemple, pour régénérer la branche salamandre, ostéoblastes, chondrocytes, neurones, muscles et les cellules épithéliales doivent être remplacé2. Ces types de cellules nouvellement généré doivent également s’organiser correctement pour faciliter la nouvelle fonction membre. Compréhension de ces processus complexes nécessite des techniques qui mettent l’accent sur la régénération des types spécifiques de cellules et de leur intégration dans les organes.
Une des stratégies employées pour simplifier l’étude des réponses régénératrices est l’ablation ciblée soit certains types de cellules ou plus grandes collections de tissus. Par exemple, chez le poisson zèbre, expression de la nitroréductase dans les types spécifiques de cellules conduit à leur destruction après application du métronidazole3,4. Chez les larves de drosophile , exprimant des gènes pro-apoptotiques sous tissu-spécifiques promoteurs peut sélectivement l’ablation des régions spécifiques du disque imaginal5,6. Deux de ces stratégies endommager rapide mais maîtrisé et ont servi à décortiquer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la régénération.
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour enlever sélectivement un organe entier appelé le pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea. Platyhelminthes sont un modèle classique de la régénération, connue pour leur capacité régénératrice prolifique, où même infimes fragments peuvent repousser toute animaux 7,8. Ils ont une grande population hétérogène de cellules souches composée de cellules pluripotentes et lignée restreints progéniteurs9,10,11. Ces cellules prolifèrent et se différencient pour remplacer tous les tissus manquants, y compris le pharynx, les systèmes nerveux, digestifs et excréteurs et les muscle et les cellules épithéliales9,10,12. Alors que nous savons que ces cellules souches lancer régénération, nous ne comprenons pas complètement les mécanismes moléculaires qui chasser pour remplacer tous ces différents types de cellules. Méthodes blessantes définies qui déclenchent des réponses précises des cellules souches peuvent aider à délimiter ce processus complexe.
Le pharynx est un gros tube cylindrique requis pour l’alimentation et contient des neurones, les muscle, les cellules épithéliales et sécrétoire13,29. Normalement caché dans une poche sur la face ventrale de l’animal, il s’étend à travers l’unique corps de l’animal, ouvrant sur la détection de la présence de nourriture. Pour sélectivement amputer le pharynx, nous tremper Platyhelminthes dans un azoture de sodium appelé chimique un anesthésique couramment utilisé dans c. elegans14,15,16. Son utilisation en Australie a été signalée par Adler et al., en 2014,12. Quelques minutes d’exposition à l’azoture de sodium, Platyhelminthes extruder leur déjà, et en agitant doucement, le pharynx se détache de l’animal. Nous appelons cette perte complète et sélective du pharynx « amputation chimique ». Une semaine après l’amputation, un pharynx entièrement fonctionnel est restaurée12. Parce que le pharynx est nécessaire pour l’alimentation, régénération fonctionnelle peut être mesurée en surveillant le comportement alimentaire. Ci-dessous, nous décrivons le protocole d’amputation chimique et pour l’évaluation de la régénération du pharynx et la restauration du comportement alimentaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode d’ablation sélective du pharynx à l’aide de l’azide de sodium. Autres études ciblées ablation en Australie ont utilisé mis à jour le chirurgie pour enlever les photorécepteurs21 ou traitement pharmacologique pour l’ablation de neurones dopaminergiques22. Un avantage significatif de l’amputation chimique par rapport aux méthodes existantes, c’est qu’il ne nécessite pas de chirurgie. La structure rigide du pharynx par r…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Alejandro Sánchez Alvarado, qui ont soutenu l’optimisation initiale et le développement de cette technique. Travail en laboratoire de Carolyn Adler est pris en charge par les fonds de démarrage de l’Université Cornell.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
Referencias
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
