שיטות מסורתיות של הערכת בידול adipogenic זול, קל לשימוש, אך אינם ספציפיים על שינויים בביטוי הגנים. פיתחנו וזמינותו של לכמת mesenchymal תאית התמיינות לתוך בוגרת adipocytes באמצעות סמן שושלת היוחסין הספציפי. Assay הזה יש יישומים שונים ומגוונים ברחבי מחקר בסיסי ברפואה קלינית.
מספר צבעים זמינים כעת עבור שימוש באיתור התמיינות של תאים mesenchymal לתוך adipocytes. צבע, כגון שמן אדום O, הם זול, קל לשימוש, שימוש נרחב על ידי מעבדות ניתוח הפוטנציאל adipogenic של תאים mesenchymal. עם זאת, הם אינם ספציפיים לשינויים שעתוק גנים. פיתחנו וזמינותו של גנים ספציפיים בידול לנתח כאשר תא mesenchymal החליף את גורלה השושלת adipogenic. Labelling חיסונית נגד חומצת שומן מחייב חלבון-4 (FABP4), סמן שושלת היוחסין הספציפי של בידול adipogenic, איפשרה ויזואליזציה, כימות של תאים. היכולת לכמת adipogenic פוטנציאל התמיינות של תאים mesenchymal בתבנית microplate טוב 96 השלכות מבטיח עבור מספר יישומים. מאות מחקרים קליניים לערב את השימוש למבוגרים תאי סטרומה mesenchymal, כיום קשה לתאם תוצאות טיפוליות בתוך ובין במיוחד כאלה ניסויים קליניים. Assay FABP4 פשוטה זו תפוקה גבוהה מספק assay כמותית להערכת פוטנציאל התמיינות של תאים נגזר החולה, הוא כלי חזקים לצורך השוואת שיטות בידוד והתרחבות. דבר זה חשוב במיוחד בהתחשב ההכרה הגוברת הטרוגניות של התאים המנוהל לחולים במוצרים תא mesenchymal. הבדיקה יש גם פוטנציאל השירות תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה, במיוחד במחקר השמנת יתר, סוכרת טרום.
אחת מהדרישות מפתח שהוקם על ידי האגודה הבינלאומית עבור הסלולר טיפול (ISCT) להגדרת תא סטרומה mesenchymal multipotent הוא שיש התאים את היכולת להבחין לתוך adipogenic, osteogenic ו chondrogenic שושלות 1. שיטות קונבנציונליות של מדידה בידול לתוך שושלות שלושה אלה מסתמכים על הגילוי של מוצרים macromolecular באמצעות צבעם1. צבעים כגון O אדום שמן (אשר כתמי טיפות השומן בתאים שעברו adipogenesis), הם זול, קל לשימוש; עם זאת הם להיכשל לזהות את השינויים הספציפיים בביטוי הגנים להתרחש כאשר תאים mesenchymal להתמיין לכל שושלת היוחסין בהתאמה2. . הנה, פיתחנו וזמינותו של בידול אשר מכמתת ביטוי חלבון עבור סמן שושלת היוחסין הספציפי adipogenic, חומצת שומן מחייב חלבון-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 נמצאה בתחילה מאתר 3T3-L1 adipocytes3 , מאוחר יותר התגלה לבוא לידי ביטוי אנושי רקמת השומן התת עורית6. זה חלבון cytosolic, אשר משמש מלווה להנחות את ספיגת חומצות שומן על ידי תאים, ומעורב בתהליך lipolysis4.
התאים קודמן המשמש את מבחני בידול היו אדיפוז נגזר mesenchymal סטרומה תאים (השיקופיים)7,8. השיקופיים חולק תכונות רבות עם הנגזרות מח העצם בתאי גזע mesenchymal (מוניטור-MSCs), אוכלוסיה העיקריים של תא גזע mesenchymal מבוגרים8,9. השיקופיים מציעים כמה יתרונות על פני BM-MSCs ביישום קליני, כפי תשואה גדולה יותר של תאים ניתן לבודד רקמת נגיש בקלות רבה יותר מקורות8,9. אוכלוסיה תא מבודד צריך לעמוד בקריטריונים מסוימים כדי להיות מוגדר השיקופיים. ראשית, הם חייבים להראות הדבקות לכלי פלסטיק תרביות רקמה תנאים תרבות תקן1. הם גם חייבים להראות ביטוי אנטיגן פני שטח1. השיקופיים מחציתה מאופיינים על ידי ביטוי חיובי האנטיגנים CD34, CD73, CD90, ביטוי נמוך של CD105, ביטוי שלילי של CD45, הלע-ד ר10. השיקופיים מטוהרת על-ידי culturing פלסטיק במשך 28 ימים (מחסידי מטוהר השיקופיים) עולה ביטוי חיובי של CD73, CD90, CD105, ביטוי שלילי CD34, CD45, ד ר הלע10. לבסוף, תאים חייב לשמור על היכולת להתמיין שונים שושלות1,7,8.
Adipogenic בידול פרוטוקולים זירוז קולטנים upregulation מרשים של ביטוי FABP4 בין גנים השושלת adipocyte אחרים, כדי שנוכל להשתמש נוגדנים כדי להמחיש FABP4 חלבון תוך תאי, ואז לכמת FABP4 ביטוי ברמת תא בודד שימוש במיקרוסקופ אוטומטי הקרנה גבוהה-תוכן פלורסנט. בשיטה זו יש יתרון על צבעי מסורתי זה מאפשר אישור ספציפי מאוד בידול adipocyte-השושלת. מבחני היוחסין הספציפי כזה הגן בשילוב עם תכולה גבוהה הקרנת שיטות גם לאפשר כימות של חלקם של תאים בתוך הכנה תא הטרוגנית המסוגלים בידול למטה שושלת מסוימת. במחקרים שלנו השתמשנו וזמינותו FABP4 לאשר אובדן הפוטנציאל בידול adipogenic של השיקופיים טרי מבודד לאחר תרבית תאים.
מאמר זה מדגים את השירות ואת היתרונות של FABP4 immunolabelling כדי לזהות ולכמת בוגרת adipocytes נגזר mesenchymal תאי סטרומה במדויק. FABP4 הוא מסוגל לזהות שינויים בביטוי של שושלת היוחסין חלבון ספציפי3,4,5 ב adipocytes בוגר, בניגוד השני נפוץ בשימוש צבעי איזה לייבל macromolecular משנה13,14 כגון שמן אדום O15, הנילוס אדום16 ו סודאן שחור17. FABP4 immunolabelling מאפשר הדמיה וניתוח של שינויים מורפולוגיה הסלולר. זהו יתרון ייחודי על השיטות שתוארו באמצעות שעתוק במהופך כמותיים PCR (RT-qPCR) מנתח שינויים ברמת התעתיק בלי שום ויזואלזציה5,18,19 ,20, או cytometry זרימה הדורשת התאים להיות השעיה20, או ווסטרן סופג את זה דורש תאים כדי להיות lysed כדי לבודד חלבון19,20. FABP4 immunolabelling יציב בתאים קבוע, לא ידלוף בתמיסה, להיות חלבון cytosolic כאשר בפורטוגלית של טפט חסיד של תאים, חפיפה עם גרעין המאפשר ויזואלזציה קל והוסיף הדיוק בניתוח אוטומטית.
הקרנה גבוהה-תוכן זה יתרון כי זה מהיר, מדויק, הדירים אובייקטיבית. הוא מספק פלטפורמה לשימוש חסכוני של ריאגנטים וזמן חוקר, מאז ייבוא תמונות וניתוח דורשות עיבוד ידני מינימלי ולהסתמך על עיבוד אוטומטי של המכשיר. מספר גורמים זוהו קריטי כדי הדיוק, מבחני הפארמצבטית בתום הקרנת גבוהה-תוכן31. כימות של אנטיגן ביטוי מסתמך על איכות התמונה. לניתוח תמונה מוצלחת, תמונות של כל אחד מערוצי לכל טוב חייב להיות בפוקוס ובסתיו בתוך טווח דינמי אופטימלית עבור ערכי אפור (הגדרות אוטומטית לחשוף אידיאליים). מתוך מיקוד או תמונות רוויות להוביל לתוצאות שגויות.
כמה מגבלות אפשריות של השיטות המתוארות במאמר זה כוללים את הבאים. הדרישה ציוד הדמיה ייעודיות ותוכנות אנליזה. בעוד שמחוץ להיקף של מאמר זה, אפשרויות לתוכנות קוד פתוח חלופי (לדוגמה, ImageJ32,33, פיג’י34,32,CellProfiler35) יכול לשמש לביצוע סגמנטציה דומה משימות; אולם הם דורשים את הכישורים כדי להוריד, חייט פקודות מאקרו זמין באינטרנט או לכתוב פקודות מאקרו/פקודות לצינורות ניתוח ספציפי שלהם. הטמון אוטומטית כל צינורות ניתוח ההדמיה היא רמה של רעש רקע. זה במידה רבה ניתן לייחס פסולת, שגיאה איכות או ניתוח תדמית, מדגישים את הצורך הכנת הדוגמא זהיר ולהגדרה זהיר של פלטפורמת הדמיה וניתוח. התווית FABP4 בעכברים נמצאה כדי לזהות אבות מובחן30; אמנם הפקדים במחקר זה (אשר מורכב של תאים מובחן) ללא צביעת FABP4 ספציפיים. זו לציונים הצורך בהכנסת FABP4 ביטוי מובחן אבות כל הקשר ביולוגי שבו מועסק וזמינותו.
כדי לצייר השוואות חוקי בין תוויות FABP4 O אדום שמן מכתים, המדידות פלט מניתוח התמונה צריך להיות רלוונטי מבחינה ביולוגית. כתוצאה מכך, המדידה, ‘% תאים חיוביים’ שימש FABP4, ‘אזור מכתים בכל תא’ שימש שמן אדום O. ראוי לציין כי המדד ‘% תאים חיוביים’ לא שימשו שמן אדום O מתויג תאים במחקר שלנו כי זה לא ניתן היה לייחס את טיפות השמן שכותרתה במדויק גרעין נתון; טיפות שומן שונות במידה ניכרת גודל, מספר והפצה, מעבר לגוף התא, לעיתים רחוקות חפפו הגרעין. O אדום שמן מכתים ההשתנות הקיים בין תאים ממקורות רקמות שונות; בזמן אחוז תאי מדידה לא היה מתאים לצורך המחקר הנוכחי, קבוצה נוספת השתמש בו בהצלחה לכמת adipocytes שמקורם בתאי גזע אנושיים בלוטת22 איפה ההכתמה שמן אדום O הופיע בתור אחד droplet שמן גדול אשר המורחב הציטופלסמה, חופף עם גרעינים ונתונים המאפשר להציג כתאי חיובי %.
לעומת זאת, המורפולוגיה של FABP4 immunolabelling הוא עקבי adipocytes נגזר מתוך מגוון של רקמות שונות מקורות23,24,25. היכולת לכמת את הפרופורציה של תאים בתוך תרבות מסוגל בידול יש מספר רב של יישומים. למבוגרים תאי סטרומה mesenchymal החזק ההבטחה משמעותי עבור מגוון רחב של שימושים טיפוליים. נושא משמעותי שקיבלנו עם תרגום קליני הוא ההשתנות הטמון בהיכולת של תאים אלה בין חולים26, בין אתרים של בידוד27,28, ובין שיטות בידוד12 והרחבה של התא מספרים12 לשימוש טיפולית. הוכח בעבר כי תרביות של תאים חסיד סטרומה הם לעתים קרובות הטרוגנית, בעל תאים מסוימים של בידול, חלקם 12,17 כמו שלנו FABP4 assay מדגים ASC תרבויות. מבחני כמו זה, בשילוב עם טכניקות העשרה, שיעזרו לזהות את תת אוכלוסיות בתוך מסוגל שושלת היוחסין הספציפי בידול הטרוגנית תרבויות. לאחר assay מתוקננת, הניתנות לכימות, כגון זו FABP4 assay מספק שיטה פשוטה לשם השוואה בין כל המשתנים הללו, ואת הפוטנציאל להעריך תוצאות טיפוליות בתוך ובין ניסויים קליניים.
כימות של FABP4 באופן אוטומטי למחצה מאפשר אובייקטיביות הפארמצבטית בניתוח מעבר התורם מקרים ודוגמאות רבות. יתר על כן כמו התווית cytoplasmic, זאת עלולה להיות בשימוש כדי לנתח היפרטרופיה (הגדלה של גודל adipocyte) בנוסף היפרפלזיה (עלייה במספר adipocyte), הבחנה זו חשיבות רבה במחקר השמנת יתר, איפה היפרטרופיה הוא קשור מאוד עם תפקוד לקוי של אדיפוז אנשים שמנים21. מגיפת ההשמנה הוא התיישר כמות משמעותית של עניין בזיהוי תרופות היכולים לשלוט אחסון שומנים בדם. זה וזמינותו FABP4 מספק גם הבדיקה פשוטה לסינון אלפי תרכובות על יכולתם לעכב הצטברות שומנים בדם.
The authors have nothing to disclose.
אנחנו אסירי תודה תורמים של רקמות adipose ומומחי מחקר מי לאסוף ולספק משאב זה לנו לשימוש מחקר ברצוננו להודות מימון תמיכה על ידי Allergan. אנו אסירי תודה גם אוניברסיטת אוקלנד, הפקולטה הרפואה, בריאות מדעי ביצועים מבוסס מחקר קרן למימון העלות של השני ועריכה להגשת מאמר זה.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |