Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a transferência de célula a célula de informação oscilatória pelo controle de optogenetic e viver monitoramento da expressão do gene. Essa abordagem fornece uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.
Abstract
Células devem responder corretamente a temporalmente mudar ambientes, que são influenciadas por diversos fatores do entorno de células. O via de sinalização Notch é um dos tais máquinas moleculares essenciais para comunicação célula a célula, que tem um papel chave no desenvolvimento normal de embriões. Este caminho envolve uma transferência de célula para célula de informação oscilatória com ritmos ultradian, mas apesar do progresso em técnicas de biologia molecular, tem sido desafiador para elucidar o impacto das interações multicelulares no gene oscilatório dinâmica. Aqui, apresentamos um protocolo que permite o controle de optogenetic e monitoramento ao vivo de padrões de expressão de gene de forma temporal precisa. Esse método com êxito revelou que o intracelulares e intercelulares entradas periódicas de sinalização Notch entrain oscilações intrínsecas por ajuste de frequência e fase de deslocamento para a resolução de célula única. Esta abordagem é aplicável para a análise das características dinâmicas de várias vias de sinalização, fornecendo uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.
Introduction
Comunicação célula a célula desempenham um papel crítico na padronização embrionária em processos de desenvolvimento. Em embriões de vertebrados, as estruturas metameric chamadas somitas são formadas ao longo do eixo ântero-posterior corpo, com uma precisão temporal precisa sob o controle de um relógio de tempo de manutenção, o relógio de segmentação1. Durante este processo, um grupo de células mesoderm presomitic (PSM) periodicamente são convertidos em somitas de forma síncrona. Este processo envolve a expressão de gene oscilatório sincronizada e células PSM que oscilam em fase formam as mesmas somitas. O período da expressão gene oscilatório é cerca de 2 a 3 h em camundongos e cerca de 30 min no zebrafish. Quando dissociado, células PSM perdem a sincronia de2,3, mas quando eles são re-agregados, podem se auto-organizar e recuperar a população sincronia4, sugerindo que o acoplamento de celular é uma chave para o sincronizado oscilações.
Extensos esforços revelaram que moléculas sinalizadoras na via Notch-Delta estão firmemente conectadas a oscilações sincronizadas dos genes do tempo de segmentação. Ou inibidores farmacológicos ou mutações genéticas de sinalização Notch desynchronize a população dos osciladores. No zebrafish, mutantes de entalhe sinalização componentes, tais como DeltaC, DeltaD e Notch1a, exibem oscilações assíncronas5,6. Em embriões de pintinho ou mouse, não só o ligante de entalhe Delta-like1 (Dll1), mas também o entalhe modulador Lunatic fringe (Lfng) é necessária para oscilações sincronizadas7,8,9. No entanto, tem sido difícil testar a capacidade funcional de tais moléculas para transferência de informação dinâmica de uma célula para outra, porque resoluções temporais de perturbação convencional da dinâmica de regulamento do gene não foram suficientes para investigar o processos de escalas de tempo de 2 – 3 h (ritmos ultradian).
Recentemente desenvolvemos um método integrado para controlar e monitorar padrões de expressão de gene em células de mamíferos,10. Esta tecnologia permite que a indução de pulsos de expressão do gene por iluminação periódica em escalas de tempo ultradian. Este protocolo representa os métodos para estabelecer linhas de células fotossensíveis e observar respostas dinâmicas de células repórter por viver-pilha luminescência monitoramento nos contextos de comunicação célula a célula. Este método é aplicável para a análise de muitas outras vias de sinalização.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós mostramos um método para controlar a dinâmica de expressão de gene com uma periodicidade de 2 a 3 h. Esta escala de tempo é muito mais curta do que os de outros sistemas convencionais, incluindo o sistema de Tet-no e o sistema de luz original. Parâmetros-chave para alcançar os prazos ultradian são meias-vidas de foto-induzido moleculares produtos mRNAs e proteínas. Estes parâmetros cinéticos podem depender de espécies e tipos de células. Para afinar a cinética, substituir sequências Hes1 3′ UTR com os …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela JST, PRESTO (I.A.), núcleo de pesquisa de evolutivo de ciência e tecnologia (JPMJCR12W2 (RK)), subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT), Japão 26119708 (I.A.) e 16 H 06480 (RK)), científico (A) (Japão sociedade para a promoção da ciência (JSPS) 24240049 (RK)), a pesquisa e jovens cientistas (A) (JSPS 15 H 05326 (I.A.)) e um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras “fluorescência Ao vivo de imagem”do MEXT, Japão e plataforma para abordagens dinâmicas para viver sistema do MEXT, Japão.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
Referencias
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