Роман пассивной очистки методы для быстрого производства оптической прозрачности в целом тканях ЦНС
Summary
Здесь мы представляем два новых методологий, psPACT и ударным, для достижения максимальной оптической прозрачности и последующего анализа микроскопических сосудистую ткани в нетронутыми грызун весь ЦНС.
Abstract
С момента разработки ЯСНОСТИ биоэлектрохимическим, очистка техника, что позволяет для трехмерных фенотип картирования в прозрачной ткани, множество Роман очистки методологий, включая КУБИЧЕСКИЙ (ясно, беспрепятственный мозга томография коктейли и Вычислительный анализ), выключатель (общесистемного управления взаимодействия времени) и кинетики химических веществ, карта (увеличенное анализ протеома) и Пакт (пассивный ясности техника), были созданы для дальнейшего расширения существующего инструментария для микроскопический анализ биологических тканей. В настоящем исследовании стремится улучшить и оптимизировать с первоначальной процедурой Пакт для массива нетронутыми грызунов тканей, в том числе всей центральной нервной системы (ЦНС), почки, селезенка и весь мыши эмбрионов. Назвать psPACT (процесс отделите пакт) и ударным (изменение пакт), эти новые методы обеспечивают весьма эффективным средством сопоставления схемы ячейки и визуализации внутриклеточных структур в нетронутыми нормальных и патологических тканей. В следующий протокол мы предоставляем подробный, шаг за шагом план о том, как добиться максимальной ткани Распродажа с минимальным вторжением в их структурной целостности через psPACT и ударным.
Introduction
Основная цель научных и клинических исследования предполагает достижение полного понимания структуры органа и функции; Тем не менее чрезвычайно сложный характер млекопитающих органов часто служит барьером для полного достижения этой цели1. ЯСНОСТЬ (ясно липидный обмен гибридизированных акриламида жесткой изображений совместимых Tisssue Гидрогель)2,3,4, который включает в себя построение гибридных гидрогеля на основе акриламида с неповрежденными тканями, достигает оптическое оформление различных органов, в том числе мозга, печени и селезенки, при сохранении их структурной целостности5. Таким образом, ясность позволило не только визуализации, но и возможность тонко анализировать сложные сотовой сети и морфологии тканей без необходимости для разрезания.
Чтобы добиться Распродажа тканей, ЯСНОСТИ использует электрофоретические методы, чтобы удалить содержание липидов образца под рукой. Хотя ЯСНОСТИ было отмечено для производства физически стабильной ткани гидрогеля гибриды, исследования показали, что его использование методов очистки (ETC) электрофоретической ткани дает разные результаты с точки зрения качества ткани, в том числе Браунинг, epitope ущерб, и протеин потери5,6. Для решения этих вопросов, модифицированных протоколы, такие как Пакт (пассивный ясности техника), который заменяет и т.д. лечение с пассивным, ионных моющих средств на основе delipidation техникой, были развитых7,8,9. Однако, несмотря на достижение большей согласованности результатов, Пакт требует больше времени, чтобы получить максимальный зазор. Кроме того ни один из этих методов еще не были применены к всей форме ЦНС, или в больших грызунов модели, такие как крысы и морских свинок.
Настоящее исследование стремится решить эти ограничения, предлагая новые методологии, psPACT (процесс отделите пакт) и ударным (изменение пакт), для облегчения быстрого разминирования всей ЦНС и внутренних органов в мышь и крыса модели10. В частности, psPACT процессов тканей в 4% акриламида и 0,25% VA-044 в два отдельных этапа во время Гидрогель образования; ударным по существу включает в себя те же шаги, но добавки на основе SDS очистки решение с 0,5% α-thioglycerol как ключевых реагента. Обе методики освоения эндогенного системных цереброспинальный сердечно-сосудистой системы и значительно сократить время, необходимое для производства оптических распродажа. Как доказательство принципа мы продемонстрировать использование confocal микроскопии для анализа закономерностей кровеносный сосуд в очищенной тканей10.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как пассивной, не электрофоретической извлечения методов, используемых в Пакт значительно улучшить согласованность достигнута с предыдущим ткани, очистка методы, такие как ясность2,3,4,7 , 8</su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана мозга Корея 21 плюс проект сайта для медицинской науки, Университет Йонсей. Кроме того эта работа была поддержана грантом от Национальный исследовательский фонд Кореи (СР 2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
Referencias
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
