Innsats for å forstå microglial funksjonen i detalj har blitt hindret av mangelen på microglial kultur modeller som recapitulate egenskapene for eldre i vivo microglia. Denne protokollen beskriver isolasjon og kultur tilnærming beregnet på vedlikeholde robuste overlevelse av svært ramified modent rotta microglia under definert mellomstore forhold.
Microglia utgjør 5-10% av alle sentralnervesystemet (CNS) celler og økende grad trekker oppmerksomhet deres bidrag under utvikling, homeostase og sykdom. Selv om makrofager har vært studert i detalj for tiår, spesialiserte funksjoner av microglia, vev-resident makrofager av CNS, har vært i stor grad mystisk, delvis på grunn av begrensninger i kunne recapitulate moden microglial egenskaper i kultur. Her viser vi en ukomplisert prosedyre for rask isolering av ren microglia fra modne gnager hjernen. Vi beskriver også serum-free oppdrettsforholdene som støtter høye nivåer av microglial levedyktighet over tid. Microglia kultivert under disse definert mellomstore forholdene utstilling forseggjort ramified prosesser og dynamisk overvåking atferd. Vi illustrerer noen effekter av serum eksponering på kulturperler microglia og diskutere hvordan disse serum-free kulturer i forhold til både serum-eksponerte kulturer samt microglia i vivo.
Som makrofager av CNS parenchyma, microglia samhandle med et stort utvalg av nevrale kretser og glial signalnettverk nettverk. De spiller viktige roller i utviklingen og homeostase i hjernen gjennom synaptic beskjæring, apoptotisk celle klarering og transient interaksjoner med neuronal prosesser1,2. Microglia er tidlig responders for nevrologiske skader, utvide sine lange, tynne prosesser til lesjon steder å koordinere inflammatorisk svar og begrense blødning3,4. Endringene i microglial morfologi og funksjon er allestedsnærværende i både akutte og kroniske CNS skader, og microglia utstillingen endret morfologi, lokalisering og uttrykk for inflammatoriske mediatorer i en rekke ulike sykdom stater1. Menneskelige genetiske studier indikerer at mutasjoner som endrer risiko for nevrodegenerative sykdommer er ofte overveiende eller utelukkende uttrykt av microglia i intakt CNS peker til en avgjørende rolle for microglia i patogenesen ved sykdom eller progresjon5 . Gitt deres framtredende i skader og sykdom, er fremme forståelsen av microglial biologi svært viktig for å utvikle nye terapeutiske metoder.
Mange viktige fremskritt til forståelsen av microglial biologi har oppstått ved å ekstrapolere teknikker og mekanismer i studier av andre macrophage befolkningsgrupper inkludert kultur metoder, gene uttrykket profiler og definisjoner av funksjonell / morfologiske stater. Selv om generalisert macrophage funksjoner ofte spilt på overraskende måter i CNS landskapet, microglia er selv høyt spesialiserte, viser en ramified morfologi og en unik gene expression signatur som skiller dem fra andre vev makrofager6. Microglia har en slektslinje som er forskjellig fra de fleste andre vev makrofager; de kolonisere CNS under en tidlig embryonale bølge av primitive hematopoiesis og selvstendig fornye gjennom livet, uavhengig av bidrag fra definitive hematopoiesis7. Fullt ut modne gene expression signatur voksen microglia oppnås ikke før den andre postnatal uke8. Miljømessige signaler fra de omkringliggende vev spiller en viktig rolle i dikterer vev-spesifikke macrophage funksjoner6, som i CNS inkluderer begrenset eksponering for blodbårne faktorer gitt av blod – hjerne barrieren9.
En helt forstå microglial bidrag til CNS homeostase og sykdom er vanskeligheten av recapitulating spesialiserte egenskapene for eldre microglia sett vivo med renset celler i vitro. Mange metoder har blitt utviklet for å isolere og kultur intakt microglia, men de fleste tilnærminger stole på serum støtte celle overlevelse. Vi har vist at tillegg av serum, som er en iboende variabel reagens som inneholder en rekke bioaktive molekyler, er særlig problematisk når arbeider med microglia fordi den fremmer en amoeboid morfologi, økt spredning, og økt fagocytose9 sett ofte i vivo når microglia er utsatt for blod båret faktorer etter avbrudd av blod – hjerne barrieren. Av disse beregningene, serum-eksponert cellene ligner microglia i skade eller sykdom stater, men slike endringer er redusert når microglia er kultivert i definerte vekstmediet som inneholder CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol og selenitt.
Denne protokollen gir detaljer for dyrking juvenile rotte microglia under serum-free forhold knyttet til nylig publiserte arbeider9. Denne protokollen er strømlinjeformet for rotter fra postnatal dag 21-30 (P21 – P30), men kan tilpasses å isolere microglia fra rotter og mus i alle aldre, om avkastning og totale levedyktighet vil variere avhengig av arter og alder på dyret. Maksimal gir og optimal levedyktighet oppnås ved litt umoden microglia (~ P9), gir og levedyktighet gradvis avsmalnende til noe lavere nivåer i voksen dyr. Microglia kan også være isolert fra mus, men vi har funnet at rotte celler Vis betydelig høyere avkastning levedyktighet og kompleksiteten i ramified morphologies, sammenlignet med musen celler i serum-free kulturer. Dyr alderen større enn P50 har ikke blitt evaluert med denne protokollen. Denne immunopanning isolasjon prosedyren er blitt optimert å minimere endringer i microglial transcriptional profiler under isolasjon og å maksimere nedstrøms levedyktigheten til cellene. Bruker disse teknikkene og media formuleringer, kan høy-levedyktigheten primære kulturer opprettholdes i uker. Microglia kultivert under disse forholdene viser en svært ramified morfologi med rask utvidelse og retraksjon av prosesser og lave relativt priser spredning. Vi understreke betydningen av serum-eksponering på disse egenskapene, og diskutere styrkene og svakhetene ved denne metoden i forhold til andre tilnærminger.
Fordi microglia fungere som sentinel immunceller av CNS, er de svært responsive til miljøendringer; stor forsiktighet må derfor minimere inflammatorisk svar i cellene under deres isolasjon og kultur8. Dette gjøres i denne protokollen gjennom hastighets- og temperaturinnstillinger. Holde cellene på isen eller i 4 ° C når mulig reduserer aktivisering, så alle sentrifugering trinnene finner sted på 4 ° C, dyrene er parfyme med iskald perfusjon buffer, og protokollen har blitt strømlinjefor…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Christopher og Dana Reeve Foundation International forskning Consortium ryggmargsskade, Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Forskningsstiftelse, JPB stiftelsen, Novartis Institute av grunnleggende forskning, sjenerøse bidrag fra Vincent og Stella Coates og Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).
Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stock reagents | |||
Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
||
Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
||
TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
||
Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | |||
Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
||
Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
||
Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
||
Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
||
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |