अलगाव और कुतर Microglia की संस्कृति सीरम मुक्त माध्यम में एक गतिशील Ramified आकृति विज्ञान को बढ़ावा देने के लिए
Summary
microglial फंक्शन को विस्तार से समझने के प्रयासों में microglial कल्चर मॉडल्स की कमी से रुकावट आ रही है जो दोहराऊंगा के गुणों को वीवो microglia में करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक अलगाव और संस्कृति को परिभाषित-मध्यम शर्तों के तहत अत्यधिक ramified परिपक्व चूहे microglia के मजबूत अस्तित्व को बनाए रखने के लिए डिज़ाइन दृष्टिकोण ।
Abstract
Microglia सभी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) कोशिकाओं के 5-10% का प्रतिनिधित्व करते है और तेजी से विकास, homeostasis, और रोग के दौरान उनके योगदान के कारण ध्यान आकर्षित कर रहे हैं । हालांकि मैक्रोफेज दशकों के लिए विस्तार से अध्ययन किया गया है, microglia की विशेष सुविधाओं, ऊतक-सीएनएस के निवासी मैक्रोफेज, मोटे तौर पर रहस्यमय, भाग में दोहराऊंगा करने की क्षमता में सीमाओं की वजह से रह गया है microglial संस्कृति में गुण । यहाँ, हम परिपक्व कुतर मस्तिष्क से शुद्ध microglia के तेजी से अलगाव के लिए एक सीधी प्रक्रिया का वर्णन । हम भी सीरम मुक्त संस्कृति शर्तों का वर्णन है कि समय के साथ microglial व्यवहार्यता के उच्च स्तर का समर्थन । Microglia इन परिभाषित मध्यम शर्तों के तहत प्रसंस्कृत व्यापक ramified प्रक्रियाओं और गतिशील निगरानी व्यवहार का प्रदर्शन । हम microglia पर सीरम जोखिम के कुछ प्रभाव उदाहरण देकर स्पष्ट करना और चर्चा कैसे इन सीरम मुक्त संस्कृतियों दोनों सीरम उजागर संस्कृतियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vivo मेंmicroglia की तुलना करें ।
Introduction
सीएनएस पैरेन्काइमा के मैक्रोफेज के रूप में, microglia न्यूरॉन सर्किट और glial सिग्नलिंग नेटवर्क की एक विशाल सरणी के साथ बातचीत । वे synaptic छंटाई, अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस के माध्यम से मस्तिष्क के विकास और homeostasis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और न्यूरॉन प्रक्रियाओं के साथ परिवर्तनीय बातचीत1,2. Microglia मस्तिष्क संबंधी चोटों के लिए जल्दी प्रतिक्रिया कर रहे हैं, उनके लंबे, पतली प्रक्रियाओं को घाव करने के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं समंवय और सीमा3,4खून बह रहा है । microglial आकृति विज्ञान और समारोह में परिवर्तन दोनों तीव्र और पुरानी सीएनएस चोटों में सर्वव्यापी हैं, और रोग की एक विविध रेंज में भड़काऊ मध्यस्थों की अभिव्यक्ति बदल आकृति विज्ञान, स्थानीयकरण, और microglia का प्रदर्शन1। मानव आनुवंशिक अध्ययन संकेत मिलता है कि उत्परिवर्तनों कि परिवर्तन neurodegenerative रोगों के लिए जोखिम अक्सर मुख्य रूप से या विशेष रूप से बरकरार सीएनएस में microglia द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, रोग रोगजनन या प्रगति में microglia के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा करते हुए5 . चोट और रोग में उनकी प्रमुखता को देखते हुए, microglial जीव विज्ञान की समझ को आगे बढ़ाने के नए चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास के लिए एक उच्च प्राथमिकता है ।
microglial जीव विज्ञान की समझ के लिए कई महत्वपूर्ण अग्रिमों extrapolating तकनीक और संस्कृति विधियों, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल सहित अंय मैक्रोफेज आबादी के अध्ययन में खोज तंत्र के द्वारा उत्पंन किया है, और कार्यात्मक की परिभाषा /morphological राज्यों । हालांकि सामान्यीकृत मैक्रोफेज कार्यों अक्सर सीएनएस परिदृश्य के भीतर आश्चर्यजनक तरीके से बाहर खेलने के लिए, microglia खुद को अत्यधिक विशिष्ट हैं, एक ramified आकृति विज्ञान और एक अद्वितीय जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर का प्रदर्शन है कि उन्हें अन्य ऊतकों से अलग सेट मैक्रोफेज6. Microglia एक वंश है कि सबसे अंय ऊतक मैक्रोफेज से अलग है; वे आदिम hematopoiesis और स्वयं जीवन भर में एक प्रारंभिक भ्रूण की लहर के दौरान सीएनएस उपनिवेश, निश्चित hematopoiesis7से योगदान से स्वतंत्र । वयस्क microglia का पूर्णतः परिपक्व जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर द्वितीय जन्मोत्तर सप्ताह८तक प्राप्त नहीं होता है. आसपास के ऊतकों से पर्यावरण cues एक प्रमुख भूमिका निभाते ऊतक-विशिष्ट मैक्रोफेज सुविधाओं6, जो सीएनएस में रक्त जनित कारकों रक्त मस्तिष्क बाधा9द्वारा दी के लिए सीमित जोखिम भी शामिल है.
एक बाधा पूरी तरह से सीएनएस homeostasis और रोग के लिए microglial योगदान को समझने के लिए recapitulating की कठिनाई परिपक्व microglia के विशेष गुणों के साथ vivo में देखा है इन विट्रो में शुद्ध कोशिकाओं । कई तरीकों को अलग और संस्कृति बरकरार microglia विकसित किया गया है, लेकिन सबसे दृष्टिकोण सीरम पर भरोसा करने के लिए सेल अस्तित्व का समर्थन । हमें पता चला है कि इसके अलावा के सीरम, जो एक स्वाभाविक चर reएजेंट है जिसमें एक विशाल सरणी के साथ सक्रिय अणुओं, विशेष रूप से समस्याग्रस्त है जब microglia के साथ काम कर क्योंकि यह एक amoeboid आकृति विज्ञान, वृद्धि प्रसार को बढ़ावा देता है, और वृद्धि हुई phagocytosis9 अक्सर vivo में देखा जब microglia रक्त मस्तिष्क बाधा के विघटन के बाद रक्त जनित कारकों को उजागर कर रहे हैं । इन मैट्रिक्स के द्वारा, सीरम उजागर कोशिकाओं चोट या रोग राज्यों में microglia के समान है, लेकिन इस तरह के परिवर्तन जब microglia सीएसएफ-1 (या IL-34), TGF-β, कोलेस्ट्रॉल, और selenite युक्त परिभाषित विकास माध्यम में प्रसंस्कृत कर रहे हैं कम कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल सीरम मुक्त शर्तों के तहत संवर्धन किशोर चूहे microglia के लिए विवरण प्रदान करता है, हाल ही में प्रकाशित काम9से संबंधित । इस प्रोटोकॉल जन्मोत्तर दिवस 21-30 (P21-P30) से चूहों के लिए सुव्यवस्थित किया गया है, लेकिन चूहों और किसी भी उम्र के चूहों से microglia को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि उपज और समग्र व्यवहार्यता प्रजातियों और जानवर की उम्र के आधार पर भिन्न होगा. अधिक पैदावार और इष्टतम व्यवहार्यता जब थोड़ा अपरिपक्व microglia (~ P9), पैदावार और व्यवहार्यता के साथ-धीरे वयस्क पशुओं में कुछ निचले स्तर के लिए पतला का उपयोग कर हासिल की है । Microglia भी चूहों से पृथक किया जा सकता है, लेकिन हमने पाया है कि चूहे की कोशिकाओं को काफी अधिक पैदावार, व्यवहार्यता, और ramified morphologies की जटिलता, जब सीरम मुक्त संस्कृतियों में माउस कोशिकाओं की तुलना में दिखाते हैं । P50 से अधिक आयु वर्ग के पशुओं इस प्रोटोकॉल के साथ मूल्यांकन नहीं किया गया है । यह immunopanning आइसोलेशन प्रक्रिया अलगाव के दौरान microglial transcriptional प्रोफाइल में परिवर्तन को कम करने के लिए और कोशिकाओं के बहाव व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया गया है । इन तकनीकों और मीडिया योगों का प्रयोग, उच्च व्यवहार्यता प्राथमिक संस्कृतियों हफ्तों के लिए निरंतर किया जा सकता है । Microglia इन शर्तों के तहत प्रसंस्कृत एक उच्च ramified तेजी से विस्तार और प्रक्रियाओं के कर्षण और प्रसार के अपेक्षाकृत कम दरों को शामिल आकृति विज्ञान प्रदर्शन । हम इन संपत्तियों पर सीरम जोखिम के महत्व पर प्रकाश डाला, और इस विधि के अंय दृष्टिकोण के सापेक्ष ताकत और कमजोरी पर चर्चा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्योंकि microglia सीएनएस के प्रहरी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में सेवा, वे अत्यधिक पर्यावरण परिवर्तन के लिए उत्तरदायी हैं; इसलिए, महान देखभाल के लिए अपने अलगाव और संस्कृति8के दौरान कोशिकाओं के भीत?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन इंटरनेशनल रिसर्च कंसोर्टियम रीढ़ की हड्डी की चोट पर, डॉ मरियम और शेल्डन जी Adelson मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, JPB फाउंडेशन, बुनियादी अनुसंधान के नोवार्टिस संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, विंसेंट और स्टेला कोट से उदार योगदान है, और Damon Runyon कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (डीआरजी-2125-12) ।
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stock reagents | |||
| Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
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| N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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| Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
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| Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
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| TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
||
| Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
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| Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
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| Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
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| Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
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| Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
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| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Referencias
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
- Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol. 6, 486 (2015).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).
