鼠小胶质细胞的分离培养促进无血清培养基动态分支形态学的研究
Summary
由于缺乏对成熟的体内小胶质细胞的特性进行重述的胶质文化模型, 胶质的详细理解的努力受到了阻碍。该协议描述了一种隔离和培养方法, 旨在维持高分支成熟大鼠小胶质细胞在确定培养基条件下的健壮生存。
Abstract
小胶质细胞代表了 5-10% 的所有中枢神经系统 (CNS) 单元, 并越来越引起关注, 因为他们的贡献在发展, 稳态和疾病。尽管巨噬细胞已经被详细研究了数十年, 但小胶质细胞, 中枢神经系统的组织驻留巨噬菌的特殊特征仍然很大程度上是神秘的, 部分原因是对成熟胶质的重述能力的限制。文化中的属性。在这里, 我们说明了一个简单的程序, 快速分离的纯小胶质细胞从成熟的啮齿动物大脑。我们还描述了无血清的文化条件, 支持高水平的胶质生存时间。在这些定义中等条件下培养的小胶质细胞具有精心的分支过程和动态监测行为。我们说明了血清暴露对小胶质细胞的一些影响, 并讨论了这些无血清的文化与血清暴露的文化和小胶质酶在体内的比较。
Introduction
作为中枢神经系统实质的巨噬细胞, 小胶质与大量的神经回路和神经胶质信号网络相互作用。通过突触修剪、凋亡细胞间隙和与神经元过程的瞬态相互作用, 它们在大脑的发育和稳态中发挥重要作用1,2。小胶质细胞是早期神经损伤反应者, 将其长而薄的过程扩展到病变部位, 以协调炎症反应并限制出血3,4。胶质形态和功能的变化在急性和慢性中枢神经系统损伤中普遍存在, 小胶质细胞在多种疾病状态下表现出改变的形态学、定位和炎症介质的表达1。人类遗传研究表明, 改变神经退行性疾病风险的突变, 通常主要或完全由小胶质细胞在完整的中枢神经系统表达, 指出小胶质细胞在疾病发病机制或进展中的关键作用5.鉴于他们在伤病和疾病中的突出地位, 进一步了解胶质生物学是发展新的治疗方法的一个高度优先事项。
对胶质生物学认识的许多重要进展, 都是通过推断其他巨噬细胞的研究中发现的技术和机制, 包括培养方法, 基因表达谱, 以及功能的定义。/形态状态。虽然广义巨噬细胞功能经常在中枢神经系统的景观中以惊人的方式发挥出来, 小胶质是他们自己高度专业化, 展示了分支形态学和独特的基因表达签名, 使他们除了其他组织巨噬细胞6。小胶质细胞具有与大多数其他组织巨噬菌不同的血统;他们殖民中枢神经系统在早期胚胎的原始造血和自我更新的整个生命, 独立的贡献从明确的造血7。成年小胶质细胞的完全成熟基因表达签名直到第二个产后周8才实现。来自周围组织的环境提示在口述组织特异性巨噬细胞特征6中起着重要作用, 在中枢神经系统中, 它包括受血脑屏障9所赋予的血液传播因子的有限接触。
充分理解胶质对中枢神经系统稳态和疾病的贡献的一个障碍是综述在体外发现的成熟小胶质细胞的特殊性质的困难, 即在体内的纯化电池为。许多方法已经发展, 以分离和培养完整的小胶质细胞, 但大多数方法依赖于血清, 以支持生存。我们已经表明, 血清, 这是一个固有的变量试剂含有大量的生物活性分子, 是特别成问题, 当与小胶质细胞, 因为它促进变形形态学, 增加增殖, 并增加的吞噬功能9经常看到体内当小胶质细胞暴露于血脑屏障中断后的血液传播因素。根据这些指标, 血清暴露的细胞在损伤或疾病状态下类似小胶质, 但当小胶质体在含有 CSF-1 (或 IL-34)、TGF β、胆固醇和亚硒酸的定义生长培养基中培养时, 这种改变就会减少。
本议定书提供了有关在无血清条件下培养幼鼠小胶质细胞的细节, 与最近发表的工作9有关。该协议已为产后 21-30 (P21-P30) 的大鼠进行了简化, 但可用于将小胶质细胞从任何年龄的老鼠和老鼠中分离出来, 尽管产量和总体生存能力将因动物的种类和年龄而异。当使用稍未成熟的小胶质细胞 (〜 P9) 时, 最大产量和最佳生存能力得到实现, 其产量和活力逐渐减少到成年动物的某些较低水平。小胶质细胞也可以从老鼠身上分离出来, 但我们发现, 与无血清培养的小鼠细胞相比, 鼠体细胞显示出的分支形态的产量、活力和复杂性显著提高。年龄大于 P50 的动物没有被这个协议评估。此 immunopanning 隔离程序已经过优化, 以最小化在隔离过程中胶质转录剖面的变化, 并最大限度地提高细胞的下游生存能力。使用这些技术和媒体配方, 高活力的初级文化可以持续数周。在这些条件下培养的小胶质细胞具有高度分支的形态学, 包括快速延长和缩回过程, 以及相对较低的增殖速率。我们强调了血清暴露对这些特性的意义, 并讨论了该方法相对于其他方法的优缺点。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于小胶质细胞作为中枢神经系统的前哨免疫单元, 它们对环境变化有高度的响应能力;因此, 在隔离和区域性8期间, 需要非常小心地最小化细胞内的炎症反应。这在这个协议通过速度和温度完成。保持细胞在冰上或在4°c 只要可能大大减少活化, 所以所有离心步骤发生在4摄氏度, 动物正在灌注冰冷灌注缓冲, 和协议已简化, 以减少组织之间的时间细胞的提取和培养。如果评估新隔离…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了克里斯托弗和丹娜基金会国际脊髓损伤研究联合会的支持, dr 和谢尔顿 g. 阿德尔森医学研究基金会, JPB 基金会, 诺华基础研究所,文森特和斯特拉的慷慨贡献, 和达蒙罗扬癌症研究基金会 (DRG-2125-12)。
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stock reagents | |||
| Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
||
| Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
||
| TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
||
| Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
||
| Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
||
| Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
||
| Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
||
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Referencias
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
- Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol. 6, 486 (2015).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).
