Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Unser Verständnis von der entwickelnden Plazenta und seine Krankheiten ist in hohem Maße begrenzt, räumliche Beziehungen zwischen benachbarten Zotten und enthaltenen Kapillaren histologischen Abschnitten abgeleitet abgeleitet. In dieser Studie haben wir dieses Problem angesprochen, durch die Entwicklung der Mittel, um dreidimensionale (3D) Darstellungen der menschlichen Plazenta Kapillare Netzwerke zu generieren, die für Analysen der Kapillare Netzwerk-Features (z. B. Verzweigungen, Festigkeit) geeignet sind. Zu diesem Zweck haben wir zusammengefasst, immunofluorescent Färbung mit zwei kommerzielle Gewebe Clearing-Produkte, Visikol-1 und Visikol-2 (im folgenden genannt als Lösung 1 und Lösung 2).

Die menschliche Plazenta ist einen riesigen Komplex von Blutgefäßen befindet sich an der Schnittstelle zwischen intervillous Blut der Mutter und den sich entwickelnden Fötus. Heraus aus ihrer Einfügung in die Chorion Platte erstreckt, verzweigt sich die Nabelschnur in ein Netz von Arterien und Venen, die zur Deckung die Chorion Oberfläche mit einem aufwendigen vaskuläre Netzwerk ramify. Ihre Enden dann nach unten in den innen- oder Tiefe der plazentaren Scheibe wo sie mehrere Generationen mehr Verzweigungen zu unterziehen und am Ende in die Klemme Zotten und ihre enthaltenen Kapillare Netzwerke, die Website für den Austausch von Gasen, Nährstoffe, eindringen und Stoffwechselerkrankungen Abfall zwischen fetalen und mütterlichen Blut.

Beleidigungen, die Plazenta Kapillarnetzes während der Entwicklung haben langfristige Folgen für die Gesundheit des Fötus, Neugeborenen und die emergent Erwachsene ^1,2,3. Im Hinblick auf Schwangerschaft zusammenhängenden Pathologien wie Fehlschlag, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und mütterlichen Diabetes ^4,5,6 gibt es ist ein hoher Wert gelegt auf die Entwicklung von Methoden zur Messung und Charakterisierung der Plazenta Zotten Kapillare Netzwerke. Ein großes Hindernis ist, dass die plazentale vaskuläre Netzwerken umfassen ein breites Spektrum der Skala. Die Oberfläche vaskulärer Netzwerke können so groß wie 4-5 mm im Durchmesser sein. Die terminal Zotten Kapillaren sind in der Größenordnung von 10 -20 µm im Durchmesser; die Plazenta enthält über 300 km Blutgefäße ⁷. Derzeit gibt es einige einfach zu bedienende und schnelle Techniken, die diesen extremen Schiff Skala erfasst werden können. Durch Mikroskopie kann bisher nur eine kleine Anzahl von Villi gerendert werden. Zum Beispiel fokussiert Jirkovska Et Al. die Plazenta Villus bei Laufzeit, kombiniert konfokale Mikroskopie mit optischen Schnittserien in 1 µm Abständen von 120 µm dicke Abschnitte erhalten; keine Angaben über die Zahl der untersuchten Proben noch Statistiken wurden ⁸. Kapillare Strukturen wurden identifiziert und Konturen der Zotten und Kapillaren waren handgezeichnete, mit Umzeichnungen zur Bildanalyse exportiert. Während die Autoren diskutieren die Folgen ihrer Erkenntnisse für das “wachsende Zotten vaskuläre Netzwerk”, sind solche Schlussfolgerungen problematisch, wenn nur “Begriff” (36 + Woche Gestationsalter) Gewebe untersucht wird. In ähnlicher Weise Mayo et einl. und Pearce Et Al. stützte sich auf das Gewebe im gleichen Alter, für ihre Simulationen von Blut und Sauerstoff-Transfer, aber ihre Analysen beschränkten sich auf nur wenige Begriff terminal Zotten ^9,10 . Stereologie wurde auch auf die Studie der Struktur der Zotten Schiffe angewendet. Aber auch hier der Schwerpunkt wurde in der Regel auf spätere Schwangerschaften liefern Liveborn Säuglinge mit einem oder mehreren Schwangerschaft Komplikationen ^11,12.

Bis vor kurzem beschränkte konfokalen Mikroskopie, Bildgebung, Gewebe Tiefen von 100-200 µm wegen Absorption der Anregung und Emission der Fluoreszenz durch das darüber liegende Gewebe ¹³ . Wenn Gewebe clearing und 3D Histologie häufig in der Literatur beschrieben wurden und es gibt gibt zahlreiche Methoden für Gewebe löschen viele ungeeignet für die Verwendung mit Gewebe in der Regel irreversibel beschädigt werden zelluläre Morphologie durch die hyperhydration von Proteinen oder Entfernung von Lipiden. Daher ist es nicht möglich zu überprüfen, ob diese Ergebnisse bezeichnend für das Gewebe selbst und keine Artefakte sind aus der Verarbeitung unserer Gewebe clearing-Prozess eine reversible Technik ist, die gegen traditionelle Histologie überprüfen kann. Gewebe-Clearing beinhaltet in der Regel einer der drei wichtigsten Ansätze: 1) einheitliche Abgleich des Brechungsindex (RI) der Gewebeanteile durch Untertauchen in RI passende Lösungen, die die kumulative Lichtstreuung verursacht durch kontinuierlichen lensing entfernt Schwankungen des niedrigen RI (Zytosol) und hohe RI (Protein/Lipide) Bestandteile; (2) entfernen Lipidkomponenten durch Einbettung in Hydrogel und Nutzung von Elektrophorese/Diffusion Lipidkomponenten entfernen; (3) Ausbau/Denaturierung von Protein-Struktur zum verstärkten Eindringen von Lösungsmitteln Förderung der Einheitlichkeit der RI ¹³. Während dieser Ansätze können Gewebe transparent zu machen und für 3D-Darstellungen von Biomarkern generiert werden, sind diese 3D-Darstellungen von zweifelhaftem klinischen Wert, da es schwierig ist, festzustellen, ob diese Bilder bezeichnend für Gewebeeigenschaften sind oder des Gewebes clearing-Prozess. Auf der anderen Seite, da unsere Gewebe löschen rückgängig gemacht werden kann Standard histologischen und/oder Immunohistochemistry einsetzbar des gleichen Gewebes zu beurteilen, ob die Veränderungen klinisch bedeutsam sind.

Diese Studie enthält eine Analyse der 47 distalen Zotten Proben aus insgesamt 23 klinisch normal und wahlweise abgebrochene Schwangerschaften zwischen 9-23 abgeschlossener Wochen Schwangerschaft und zwei voll ausgetragenen normale Lieferungen. Immunfluoreszenz Kennzeichnung der Trophoblast und Gefäßendothelien ermöglichte eine quantitative und automatisierte Analyse der Veränderungen in den Zotten vaskulären Netzwerken und ihrer Komplexität.

Mit diesem Protokoll wir isoliert und analysiert zuvor terminal Zotten und ihre Kapillare Netzwerke auf einer Skala nicht möglich. Dieser Ansatz, wenn Zotten und Kapillare Netzentwicklung über Schwangerschaft angewendet werden diese Eigenschaften identifizieren, die die Grundlage für die Geburt eines gesunden Kindes sind. Bei Anwendung auf Studien von komplizierten Schwangerschaften wird es auch klären, wann und wie die plazentalen Pathologien zu ändern, die Zotten Bäume und die Kapillare Netzwerke, die sie Scheide und wie diese fetalen Wohlbefinden beeinträchtigen.