核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展
Summary
我们描述了一个协议, 为临床前在体内跟踪肿瘤转移。它的基础上的放射性核素荧光记者结合碘化钠转运体, 检测到非侵入性 [18 F] 氟硼酸盐-PET, 和荧光蛋白, 简化了前体确认. 该方法适用于肿瘤生物学以外的临床前体内细胞追踪。
Abstract
转移是导致大多数癌症死亡的罪魁祸首。尽管进行了广泛的研究, 机械上对转移控制的复杂过程的理解仍然不完整。体内模型对于转移研究至关重要, 但需要细化。通过非侵入性的体内成像跟踪自发转移现在是可能的, 但仍然具有挑战性, 因为它需要长时间观察和高灵敏度。我们描述了一个纵向联合放射性核素和荧光全身在体内成像方法跟踪肿瘤进展和自发转移。这个记者基因方法论使用碘化钠转运体 (NIS) 融合到荧光蛋白 (FP)。肿瘤细胞的设计, 以稳定的表达 NIS, 然后选择基于荧光活化细胞排序。在小鼠中建立了相应的肿瘤模型。使用 nis 放射性 [18F] BF4–, 通过正电子发射层析成像 (PET) 在全身水平追踪表达癌细胞的非侵入式的体内。PET 是目前最敏感的体内成像技术, 可在此范围内使用, 并实现可靠和绝对量化。目前的方法要么依靠大规模的动物群, 为转移评估在不同的时间点, 或依赖于几乎可量化的2D 成像。所述方法的优点是: (i) 高度敏感的非侵入性体内3D pet 成像和量化, (二) 自动 pet 示踪剂生产, (iii) 由于重复成像选择, 大量减少所需的动物数量 (iv)从随后的成像会话中获取配对的数据, 提供更好的统计数据, (v) 通过荧光显微镜或细胞仪对组织中的癌细胞进行前体确认的内在选择。在本协议中, 我们描述了常规 NIS FP 提供的非侵入性体内癌细胞跟踪所需的所有步骤, 使用 PET/CT 和前体确认体内结果。当在体内定位、扩展和对细胞群进行长期监测时, 该协议的应用超出了癌症研究的范围。
Introduction
转移性疾病是导致大多数癌症相关死亡的原因1。尽管对转移过程进行了广泛的研究, 但对动物模型系统中肿瘤转移的可靠监测很难实现。在全身成像技术和多模态成像方法方面的最新进展使非侵入性的体内细胞跟踪2,3,4,5。后者可作为一种工具, 监测细胞的存在、分布、数量和生存能力, 非侵入性和反复在活的动物或人类。
这里描述的方法的目的是在3D 的活体啮齿动物肿瘤模型中纵向和非侵入性的跟踪癌细胞。使用这种方法, 研究人员将能够准确量化肿瘤进展, 包括转移扩散在3D。与传统的非成像技术相比, 该方法提供了大量减少动物数量的定量数据的获取。此方法的另一项功能是, 它允许通过组织学或细胞术3、6, 将体内成像与经过简化的下游前体分析所收获组织中的跟踪细胞进行关联。
这一方法的发展的基本原理是提供一个体内工具, 以监测和量化的整个转移过程的啮齿动物肿瘤模型。重要的是, 它的目的是尽量减少动物的使用, 同时减少动物间的变异。纵向无创全身成像是非常适合告知转移性生长, 而本身很难准确预测其发生的时间和地点. 因此, 全身3D 成像一直是方法开发的中心。为了缩小全身体内成像和潜在的下游前体组织学确认之间的比例差距, 采用了基于双模式核素荧光报告器的多尺度成像方法3, 6。
正电子发射层析成像 (PET) 是目前可用的最敏感的3D 全体成像技术, 提供卓越的深度穿透和绝对量化7 , 分辨率为 < 1 毫米8,9。目前, 放射性核素成像对全身水平的临床前细胞追踪可以可靠地检测到每卷100万个细胞的密度为1000个细胞的细胞(3,6 ), 并在亚毫米区域有分辨率。与活体显微术不同, 它不能检测单个癌细胞的传播, 但不需要手术程序 (例如, 如窗口室), 不限于小范围的视野, 而不是通过低组织穿透和分散。生物发光成像提供了一种廉价的替代方法, 但与散射和光吸收问题以及深度渗透率差有关, 因此在量化2中受到严重限制。荧光全身成像已被用于获取3D 图像, 但它比生物发光或放射性核素技术2更敏感。尽管如此, 荧光提供了通过细胞术或显微镜进行前体下游组织分析的机会。后者关闭了宏观全身成像 (mm 分辨率) 和荧光显微组织分析 (µm 分辨率) 之间的尺度间隙3。因此, 放射性核素和荧光模式相辅相成, 从全身水平到 (分) 细胞尺度不等。
在转移研究中, 报告基因成像非常适合于延长细胞追踪的需要。在这个应用中, 它优于直接细胞标记, 因为它是 (i) 不受标签稀释的影响, 从而不限制在跟踪时间, (ii) 更好地反映活细胞数。因此, 全身细胞跟踪对于可追踪细胞增殖或扩展体内(例如癌症研究36) 的应用程序特别有用, 用于检测茎部畸胎瘤的形成。细胞研究, 或免疫细胞膨胀的量化5。
各种放射性核素为基础的报告基因可用2。这些酶包括单纯疱疹病毒 HSV11 胸苷激酶 (HSV1-tk), 转运体, 如碘化钠转运体 (NIS) 或去甲肾上腺素转运体 (NET), 以及细胞表面受体, 如多巴胺 D2 受体 (D2R)。NIS 是一种糖化的跨膜蛋白, 主动调节碘吸收, 例如在甲状腺卵泡细胞为随后合成甲状腺激素10。此过程由 na+的 symport 驱动, 依赖于由 na+/K+-atp 酶11维护的细胞钠梯度。因此, 由于碘/放射性摄取链接到活动 Na+/K+渐变而不是仅仅存在传输器, NIS 比其他记者更好地反映活细胞数。传统上, radioiodide 已用于 NIS 映像。对于细胞追踪, 未被报道在甲状腺内代谢的替代 NIS radiotracers 被报告为高级6。最近开发的 PET 放射性 [18f] 四氟硼酸 ([18f] BF4–)12,13显示优于 radioiodide6的药代动力学, 同时被可在高特定活动14中使用, 而不需要复杂的放射化学设施。[18F]BF4可以通过两种不同的方法进行合成.第一种方法是基于在 BF4与放射性18F12的非放射性的19F 的同位素交换。第二种方法是将18F 添加到非放射性的三氟化硼14中。报告后一种方法可产生更高的特定活动14 , 是临床前成像的首选方法。
NIS 在甲状腺组织中有很高的表达。它也表达在唾液, 泪和泌乳乳腺以及胃, 但在较低的水平相比, 甲状腺10。因此, 可以使用 NIS 来实现其他体区域的优异对比度成像。它也高度同源的人, 鼠和鼠标10。此外, 在非甲状腺细胞中没有对异位 NIS 表达的毒性报告。重要的是, NIS 也没有与宿主免疫应答相关, 无论是人类还是啮齿动物。NIS 已被用作测试启动器活动的报告基因15,16,17和基因表达式18,19,20,21,22 ,23在几个不同的上下文中。它也被用于基因治疗载体的非侵入性成像24,25, 并跟踪心脏4, 造血26, 炎症5和神经研究27的细胞。最近, NIS 也被用作跟踪肿瘤转移的报告基因在体内3,6。
总之, 此方法优于以前的技术的主要优点是: (i) 高度敏感的非侵入性 3D在体内定位和量化转移扩散, (二) 自动化生产 [18F] BF4– at高摩尔活动, (iii) 通过纵向成像大幅度减少所需的动物, (四) 从随后的成像会议获得配对的数据, 从而改进统计数据, 进而进一步减少动物的使用, (v)通过细胞术或荧光显微镜在组织中确认癌细胞的内在选择.
Protocol
Representative Results
Discussion
通过此方法使癌细胞可溯源到体内的第一步需要工程它们来表达 NIS-FP 融合报告。在融合报告中, 荧光蛋白的选择是至关重要的, 因为 oligomerizing 荧光蛋白可以导致人工的报告聚类, 从而对其功能产生负面影响。我们已经成功与证明单体荧光蛋白, 如 mEGFP (monomerizing 突变 A206K36,37), mTagRFP, 或 mCherry。NIS 可以是人或老鼠起源 (hNIS 或 msNIS) 取决于实验的目的和癌症模型。转导效率通常在不同的癌细胞系之间变化。然而, 在本议定书中, 产生的癌细胞系随后被净化, 从而减少了优化转导条件的需要。转导与高多样性的感染并不总是可取的, 因为多重结构整合到基因组可能会导致不仅在更高的构造表达, 而且在更不需要/不受管制的基因组修改。因此, 让多克隆转基因细胞生长到表达的稳定性是很重要的 (流式细胞仪监测), 并避免仅通过观察者对最明亮的克隆进行排序。它还使非报告功能的功能验证在这些单元格应用于体内实验之前至关重要。最近开发的替代病毒基因传递是基因编辑技术38, 它提供了更具体的控制病毒整合网站。流式细胞术和免疫印迹法表达分析是很重要的。流式细胞术允许获取基于人口的单细胞数据, 例如, 检查是否有任何漂移在记者的表达水平随着时间的推移。它只依赖 FP 基团, 除非细胞也沾有针对表面或全 NIS 的抗体。流式细胞术不通知融合记者的完整性。相比之下, 免疫印迹法报道了融合记者的完整性。必须增加 nis 和 fp 的分子量, 以确定所选择的 nis fp 的预期分子量. 共焦荧光显微术显示融合记者定位与等离子膜标记小麦胚芽凝集素在所有新的做了细胞系。这是大多数蛋白质的预期细胞位置, 并指出了后续功能验证的前进里程碑。如果在等离子膜上发现了最小/no NIS (例如仅在内部蜂窝隔间), 这将表明与该细胞系中的融合记者的细胞生物学问题, 或融合记者潜在的突变影响其细胞内贩运。值得注意的是, 我们没有观察到迄今为止我们测试过的任何癌细胞中的这种情况, 其中包括: A375P、A375M2、SK-Mel28、WM983A/B (人黑色素瘤);MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (人乳癌);NCI-H1975 (人肺癌);SK-Hep1 (人肝癌);4T1, 4T1.2, 66cl4, 67NR, FARN168 (小鼠炎症性乳腺癌);B16F0, B16F3, B16F10 (小鼠黑色素瘤);MTLn3 (大鼠乳腺腺癌)。
nis 函数必须使用具有放射性 NIS 基底的吸收检测来测量。由于显式放射性99mTcO4是生成器, 因此在医院中广泛提供, 而无需任何放射性合成, 并且具有更方便的更长半衰期 ( 99m的6.01 小时Tc 与18F 相比为110分钟), 我们使用此 NIS 基板对新的 nis FP 表示单元格行进行常规功能验证。用 nis co 基片对 nis 表达细胞进行预阻塞, 导致放射性吸收的预期减少/废除, 从而表明放射性吸收的特异性。此 NIS 专用性测试是关键的验证步骤。如果 nis 特异性实验不会导致放射性摄取量与各自的父母细胞相媲美, 则在实验过程中出现技术错误, 或者放射性摄取不是由 nis 引起的。此外, 高氯酸钠预堵塞也可能减少父母细胞系中的放射性吸收;这将识别具有内源功能 NIS 表达式的单元格线 (例如刺激的甲状腺细胞6)。
此映像协议的一个关键优点是, 信息是在3D 和一段时间内收集的。这允许比较同一动物的图像, 随着时间的推移, 从而提供配对的数据, 从而克服了动物间的变异引起的问题。这与大多数非成像相关的转移评估方法相比, 是基于在不同时间点牺牲不同的动物。在图 3B中, 显而易见的是, 随着时间的推移, 转移性传播和生长产物在单个动物中的进展情况。PET/CT 图像检测的信号从根本上是由 NIS 表达引起的。这包括所有的信号从外部 nis 表达癌细胞和所有器官内在表达 nis。典型的内源性 NIS 信号在甲状腺和涎腺, 胃, 以及在乳腺和泪腺体的某些部位的低水平中发现。除了内源 NIS 表达式之外, nis 放射性 [18F] BF4也通过肾脏排泄, 从而解释了尿液填充膀胱中的放射性摄取量.在本协议建议的成像时间点 (45 分钟后放射性注射6) 中, 肾脏吸收不再被检测到。如果来自尿液膀胱的信号会导致信号到背景的问题, 膀胱可以在麻醉前机械地排空, 然后再进行成像。重要的是, 内源信号可以不同的动物菌株。另外值得注意的是, 在泌乳条件下, 乳腺内源性 NIS 的表达可能会更高10。在所提出的情况下, 在这些转移细胞线的情况下成功地描绘之前 (cf列表), 我们没有发现内源 NIS 表达, 以显著干扰转移检测。值得注意的是, [18F] BF4-与碘化物相比, 仍然可以更有效地吸收到癌变组织中, 因为碘化物代谢成甲状腺激素6。与 [18F] BF4-6相比, 这种现象也可能导致血流中 radioiodide 的数量增加。对于不同的应用 (癌症细胞追踪在其他癌症或非肿瘤细胞追踪应用), 这可能会有所不同, 因此建议评估内源 NIS 表达式是否可能导致信号到背景的问题, 通过初步实验。临床前成像的一个重要方面是放射性的摩尔活动。此处描述的方法使用 1.5 GBq 18F 作为起始材料 14 , 并已显示出在先前报告的替换方法12上产生的摩尔活动显著高于此。[18F]BF4-在摩尔活动中产生≤1 GBq/µmol12可导致对 NIS 表达组织的吸收减少。这是特别重要的, 当注入量的放射性每公斤高,即当小动物如小鼠被成像39;它在人工设置40中不那么重要。因此, 高摩尔的活动是至关重要的高质量的前临床 PET 成像。三氟化硼添加方法所获得的摩尔活性14在本协议的自动表单中显示, 克服了此问题。此外, 值得注意的是, 为 [18F] BF4合成而提出的协议不符合良好的生产实践 (GMP), 因此不适用于这种形式的人体临床试验.GMP协议 (通过18F 替换方法到 radiolabel BF4) 在别处可利用40。
PET/CT 成像允许可视化的放射性摄取, 这表明了 nis 介导的放射性的吸收, 源于 nis 表达癌细胞。更重要的是, 相关的 PET 信号可以量化。有必要采用可靠的阈值程序, 以确保从任何潜在背景中对相关信号进行一致和无偏见的区分。由于背景变化在不同的位置在体内, 重要的是考虑局部/区域的阈值和分割。一个这样的方法是通过和命名的, 在大津34之后开发的, 它的3D 实现被用于3D 呈现本协议中的原发肿瘤和转移。通常情况下, 观察者所看到的图像相对于量化的%injected 剂量 (%ID) 值是最好的。至于基于图像的量化, 也重要的是标准化的测量放射性值的不同组织的体积。有两种主要使用的方法表示规范化的结果, (i)%ID 每卷 (例如%ID/mL), 和 (ii) 标准摄取值 (SUV35)。它们的不同之处在于,%ID/mL 仅考虑到单个体积, 而 SUV 则是相对于整个动物的平均放射性的量度。还必须注意的是, NIS 映像呈现活体肿瘤容积 (按揭), 因为未合成 ATP 的死/死细胞不能再导入放射性10。这解释了大的低信号区域在主要肿瘤 (“圆环形” 肿瘤) 表明区域肿瘤细胞死亡或坏死。重要的是, 与测径仪测量的粗肿瘤体积相比, 按揭是一种更可靠的肿瘤负担测量方法 (不考虑生存能力和仅评估表面肿瘤区域)。
这种双模式跟踪策略的一个主要优势是明显的, 当收获组织后, 动物剔除。以体内图像为指导, 在动物解剖过程中由荧光癌细胞辅助, 也可以可靠地收获小而深的器官/转移物。冷冻组织保存/切片方法可以直接荧光成像的 gfp 不需要染色的抗 GFP 抗体, 但以减少结构组织保存比福尔马林固定石蜡嵌入方法学 (FFPE)。后者批判地也需要抗 FP 染色, 因为 FFPE 方法是不相容的荧光蛋白的完整保存 (由于固定/脱水/补液)。虽然荧光信号表明肿瘤细胞存在, 但重要的是要确保这种分类被证实的体外放射性测量的收获组织 (‘ 体内 ‘). 前体放射性测量比目视荧光检测更敏感, 因此可以识别癌细胞依赖的信号, 否则将无法被发现。在终端成像会话的情况下, 重要的是要准确地注意到注射放射性量以及放射性放射性测量的次数, 动物注射, 动物剔除, 和校准闪烁计数器测量收获的组织。这是至关重要的, 以确保纠正放射性衰变, 从而使可靠的体内分析。
PET/CT 成像能够重复非侵入性的3D 定量肿瘤进展, 包括评估转移扩散的全身水平。这一特征比传统方法有显著的优势, 通常依赖于大规模的动物群, 在不同的时间点对肿瘤进展进行评估。这种基于图像的方法的优点是: (i) 高度敏感的非侵入性 3D体内量化, (ii) 由于重复成像的可能性, 动物数量显著减少 (iii) 获得纵向配对数据从随后的影像学会话中, 通过排除动物间的变异来改善统计数据, 这反过来又进一步减少动物数量, (iv) 在高特定活动时自动生产 [18F] BF4– (v)在组织中通过荧光方法 (如显微镜或细胞术) 确认的前体的内在选择。
体内单元格跟踪是一个不断增长的字段。近年来, 成像技术取得了新的进展, 从而提高了分辨率、检测极限和多重能力 (通过多模态成像)。在本议定书中, 我们应用这个概念来跟踪肿瘤进展, 包括自发性癌细胞转移在3D 通过重复成像。应用包括旨在解开自发性癌细胞转移机制的研究。例如, 可追踪的肿瘤细胞可以用来研究不同免疫细胞成分 (在不同 immunocompromisation 水平的动物菌株中的目前/功能) 对转移过程的影响。同样, 可以研究单个基因在动物菌株或癌细胞系中的影响。此外, 所提出的议定书可用于评估/验证特定药物或治疗概念对肿瘤进展的有效性。重要的是, 这个记者基因: 放射性对 PET 成像 (NIS: [18F] BF4–) 也可以用于不同的单元跟踪应用程序。例如, 一些细胞疗法目前正在成为有希望的治疗方法。这包括癌症治疗的细胞疗法41 , 但也在移植42和再生医学43,44设置。全身性的体内细胞追踪对细胞疗法的发展和临床翻译变得越来越重要, 例如, 评估安全性和治疗监测。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了伦敦国王学院的支持, 并获得英国大学的综合癌症影像中心的资助, 由癌症研究和 EPSRC 与湄公河和卫生部 (英国) 联合提供资金;美国国立卫生研究院 (NIHR) 生物医学研究中心, 总部设在男、圣托马斯的 NHS 基金会信托和伦敦国王学院;由威康信托基金和 EPSRC 资助的医疗工程卓越中心, 拨款数量 088641/z/09/z;一项癌症研究英国多学科项目奖给 GOF 和 PJB, 并且国王的健康伙伴授予 GOF。nanoPET/ct 和 nanoSPECT/ct 扫描仪是购买和维护的设备赠款从威康信托基金。所表达的观点是作者的意见, 不一定是 NHS、NIHR 或卫生署。
Materials
| Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
| 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
| 4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
| Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
| CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
| CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
| Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
| Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
| Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
| DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
| FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
| Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
| Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
| MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
| pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
| pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
| pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
| Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
| Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
| Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
| SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
| Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
| Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
| Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
| Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
| Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
| Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
| Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
| Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
| Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
| Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
| 15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
| Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
| Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
| Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
| Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
| Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
| Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
| Water for injection USP | GE Healthcare | ||
| Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
| Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
| Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
| Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
| Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
| Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
| Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
| Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
| Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
| Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
| 5) In vivo data analysis. | |||
| Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
| VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
| 6) Ex vivo analyses | |||
| 2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
| Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
| Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
| Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
| Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
| Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
| Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
| Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
| Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
| O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
| Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
| Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
| Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
| Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 | |
Referencias
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