Qui presentiamo un protocollo per la produzione controllata di microcristalli di proteina. Il processo utilizza un dispositivo automatico che permette la manipolazione controllata di diversi parametri di cristallizzazione. La cristallizzazione della proteina avviene mediante aggiunta automatizzata e controllata di soluzioni di cristallizzazione durante il monitoraggio e indagare la distribuzione di raggio delle particelle nella gocciolina di cristallizzazione.
Il dispositivo automatico di cristallizzazione è una tecnica brevettata1 appositamente sviluppato per il monitoraggio di esperimenti di cristallizzazione della proteina con l’obiettivo di manovrare precisamente la nucleazione e crescita dei cristalli verso formati voluti dei cristalli della proteina. La cristallizzazione controllata è basata su esempio di analisi con in situ Dynamic Light Scattering (DLS), mentre tutti i cambiamenti visivi a goccia sono monitorati online con l’aiuto di un microscopio accoppiato ad una fotocamera CCD, consentendo in tal modo un pieno indagine della goccia proteina durante tutte le fasi della cristallizzazione. L’utilizzo di in situ misurazioni DLS in tutto l’intero esperimento permette una precisa identificazione della soluzione della proteina altamente supersatura transizione ad una nuova fase – la formazione di nuclei di cristallo. Identificando la fase di nucleazione della proteina, la cristallizzazione può essere ottimizzata da cristalli di grandi proteine per la produzione di proteina microcristalli. Il protocollo sperimentale Mostra una cristallizzazione interattiva approccio basato su precisi passaggi automatizzati come precipitante aggiunta, l’evaporazione dell’acqua per soprasaturazione alta d’induzione, e diluizione del campione per il rallentamento indotto nucleazione omogenea o transizioni di fase di retromarcia.
Negli ultimi anni, la crescita delle proteine micro e nanocristalli ha catturato l’attenzione della comunità di cristallografia di proteine, soprattutto con lo sviluppo continuo di Serial Femtosecond Crystallography (SFX). Dovuto la brillantezza della radiografia romanzo radiazione fonti e basato sui risultati di successo ottenuti finora, la produzione di proteine micro – e nanocristalli sono diventata di grande rilevanza, che propone una forte domanda sulla preparazione di tali sospensioni cristalline 2 , 3. a causa della dimensione di piccolo cristallo-gamma necessaria per la raccolta di dati a laser ad elettroni liberi (XFELs) e la limitata disponibilità di valutazione sperimentale, caratterizzazione del campione prima della raccolta dei dati è essenziale. Le più comuni tecniche per caratterizzare sospensioni di micro – o nanocristallo di proteina sono fino ad ora la microscopia elettronica e diffrattometria di raggi x.
Finora, diversi approcci sono stati adattati da metodi di cristallizzazione comuni con l’obiettivo di produrre quantità di massa di cristalli di proteine con dimensioni nella gamma piccola micrometro. Il metodo batch viene utilizzato per la miscelazione veloce di alta proteina concentrata e soluzioni precipitante, costringendo così la soluzione di esempio ad una fase altamente supersatura dove nanocrystallization potrebbe essere favorito4. Altri metodi includono schiacciamento cristalli di grandi proteine per formare un impasto di cristallo, che può servire come nanocristallino sospensioni da utilizzare per la raccolta di dati5. Tuttavia, i risultati a volte potrebbero causare in qualità di diffrazione in diminuzione, come deteriorato i cristalli hanno ordine interno inferiore. Nanocrystallization basati sulla interfaccia libera diffusione è anche un’alternativa disponibile, dove soluzione proteica viene aggiunto in piccole quantità per una soluzione precipitante altamente concentrato3. Tuttavia, tra tutte le tecniche, le metodologie più efficaci sembrano essere la cristallizzazione di batch e più innovative tecniche manipolative, utilizzando metodi di diffusione del vapore in seduta gocce6.
In generale, per la cristallizzazione di una proteina una barriera di energia dovrà essere attraversata per supportare nucleazione – il primo passo termodinamico nella formazione di cristalli. In ordine di spostare la soluzione della proteina da uno stato termodinamicamente stabile a soprasaturazione e infine per indurre una transizione di fase, alcune variabili legate alla soluzione della proteina devono essere modificato. Tali variabili sono solitamente la concentrazione della soluzione della proteina, modifiche ambientali (ad es., temperatura, umidità), caratteristiche di solvente (ad es., pH, forza ionica), proprietà di concentrazione e buffer, ecc7 ,8 una panoramica dei parametri di esempio che può essere cambiata è rappresentata solitamente per mezzo di diagrammi di fase, che consentono diverse modalità di presentazione, come solubilità diagrammi, diagrammi di fase di nucleazione o anche più dettagliate descrizioni di cui diagrammi tridimensionali o più complessi possono venire in considerazione8,9,10. I tipi più attraenti di diagrammi di fase sono solitamente bidimensionali, dove la principale variabile è la concentrazione di proteine in funzione di un altro parametro, mentre i restanti parametri sono mantenuti costanti6,11. Una volta che uno o pochi nuclei si formano, più grandi cristalli possono crescere prendendo le altre proteine dalla soluzione alla rinfusa. Quando si mira per la produzione di micro – e nanocristalli, un tale approccio di cristallizzazione convenzionale non è fattibile piu ‘ dovuto il piccolo numero di cristalli che sono presenti in soluzione. Nanocristallino sospensioni solitamente devono essere ricca in entità cristallina, così che la via di cristallizzazione deve essere riadattato, tale che esiste una maxima di eventi di nucleazione presenti nel campione. Di conseguenza, questo richiede l’indagine di alcuni nuovi, fino alle vie di nucleazione ora inesplorate per le proteine, che sono anche ancora non pienamente compreso12,13. Basato sui fondamenti del diagramma di fase accennati in precedenza, la teoria classica è stata estesa a una nuova ipotesi, dove nucleazione è descritta come un meccanismo in due fasi: in un primo momento, una transizione verso una maggiore concentrazione di proteine avviene (liquido denso fase) e la seconda, una transizione da una fase densa ricco a un più alto ordine interno (nuclei di cristallo con l’architettura della grata)14,15,16. Cristallizzazione della proteina è sensibile a molti fattori, e quindi quando ricette di cristallizzazione sono riadattate per provocare i cristalli di dimensioni diverse, le ricette non possono sempre contare sulla conoscenza precedente. Nuove intuizioni devono essere stabiliti per ogni destinazione di singole proteine: regolazione della composizione di buffer, la purezza e la stabilità del campione, precisa conoscenza di solubilità di proteine, ecc.
Diffusione dinamica della luce è oggi un metodo ben consolidato per analisi e ottimizzazione dei processi di cristallizzazione di proteine, a causa di una vasta gamma di dimensioni di particelle che possono essere studiate: dalle proteine monomeriche di nanocristalli e piccolo microcristalli. Il metodo sfrutta che particelle in soluzione subiscono il moto browniano e che la velocità media di questo movimento è determinata dalla dimensione delle particelle, loro energia termica e dalla viscosità del mezzo e la geometria delle particelle. In un primo momento, il mezzo liquido è illuminato da una sorgente luminosa coerente con l’uso di un laser. La luce diffusa dalle particelle si sta formando un modello di interferenza. Perché le particelle sono in moto permanente la figura di interferenza cambia anche definitivamente. Quando si cerca in una certa direzione, fluttuazioni di intensità possono essere osservate. Queste fluttuazioni sono ora Mostra il movimento delle particelle causato dal moto browniano. Dalle fluttuazioni di intensità misurata viene calcolata una funzione di autocorrelazione (ACF). Un’analisi del file ACF darà una misura per la distribuzione di velocità (più precisamente il coefficente di diffusione) di particelle e utilizzando l’equazione di Stokes-Einstein, viene convertito in un raggio di particelle distribuzione17. Ulteriori informazioni relazionati alla funzionalità DLS e principio di funzionamento possono essere trovati in varie pubblicazioni e libri18,19.
Qui applichiamo e descrivere un dispositivo unico cristallizzazione automatizzata, il XtalController900, una versione aggiornata del XtalController tecnologia6, sviluppato proprio per il monitoraggio di esperimenti di cristallizzazione della proteina interattiva. Questa tecnica Mostra un alto potenziale per identificazione e monitoraggio di eventi di nucleazione in tempo reale, permettendo una precisa manovra attraverso il diagramma di fase di cristallizzazione. Lo scopo di questa procedura di cristallizzazione particolare è quello di ottimizzare la cristallizzazione di proteine per ottenere proteine di alta qualità micro – e nanocristalli che sono adatti per applicazioni che utilizzano sorgenti di raggi x di sincrotrone micro-focalizzato, diffrazione dell’elettrone, o SFX.
Il dispositivo di cristallizzazione è progettato per monitorare e modificare i parametri cruciali durante un esperimento di cristallizzazione basato su un metodo modificato vapor-diffusione. Questa tecnica consente il monitoraggio e segnando un esperimento di cristallizzazione della proteina in tutte le fasi, permettendo all’utente di avere una conoscenza precisa e il controllo della soluzione della proteina durante il diagramma di fase di cristallizzazione, basato su in situ analisi DLS della sospensione del campione.
Il dispositivo di cristallizzazione comprende una camera sperimentale (Figura 1) collegata a una telecamera CCD che consente di monitorare in tempo reale la goccia di cristallizzazione. La fotocamera è adattata ad un microscopio dotato di lenti di ingrandimento diverse, fornendo una massima risoluzione spaziale di circa 2,5 µm. Il nucleo della camera sperimentale è una microbilancia ultrasensibile per seguire l’evoluzione del peso campione nel tempo. La procedura di cristallizzazione corrisponde a un esperimento di seduta-goccia vapor-diffusione, dove la goccia di proteina è posta su un vetrino coprioggetti siliconato, che si trova sulla microbilancia. Sulla base delle variazioni di peso della goccia, sono causate da precipitante aggiunta, aggiunta di additivo/acqua o evaporazione di campioni, la microbilancia dà un preciso input per un algoritmo per il calcolo immediato della concentrazione proteica e precipitante nel tempo . Inoltre, parametri di cristallizzazione importanti quali temperatura e umidità relativa precisamente sono monitorati e controllati.
Al fine di eseguire un esperimento di cristallizzazione, il dispositivo è dotato di due sistemi di micro-dosaggio (contattare gratis pompe piezoelettriche) che lavorano in una scala di picolitri per aggiunta di acqua e precipitante. Lavorando con tali piccole quantità di sostanza, i gradienti di concentrazione e il fenomeno di convezione all’interno della gocciolina di proteina sono ridotti al minimo. Il ruolo principale delle pompe piezoelettriche è l’aggiunta di acqua, quest’ultimo ad esempio utilizzato come compensazione per evaporazione naturale della goccia della proteina o precipitante. I sistemi di micro-dosaggio hanno un set di caratteristiche, che possono dettare l’aggiunta di una sostanza. Tali caratteristiche includono: il tasso di ripetizione per l’aggiunta di una sostanza, il numero di goccioline aggiunto al secondo, la larghezza e l’altezza della traiettoria del flusso di sostanza, ecc. Inoltre, la posizione delle pompe può essere regolata manualmente, consentendo all’utente di avere una posizione precisa per l’aggiunta di sostanze nella goccia di proteina.
La manipolazione del feedback unico controllato della goccia cristallizzazione si ottiene in situ dati DLS, che possono mostrare eventuali cambiamenti nello stato proteina oligomerica durante tutta la procedura sperimentale. La tecnica permette la costante valutazione della distribuzione di dimensione delle particelle nel tempo, rivelando così sconosciuti meccanismi correlati della proteina. L’attrezzatura ottica DLS è posizionato strategicamente sotto l’area del vetrino coprioggetto, permettendo il fascio laser e rilevatore di passare attraverso il vetrino coprioggetto e ulteriormente attraverso la goccia di proteina in una moda in situ ; Pertanto, solo le modifiche entro la goccia vengono registrate dal percorso DLS. Per consentire un’agevole manipolazione, il dispositivo è dotato di due aperture: una porta d’ingresso per un posizionamento ottimale del vetrino coprioggetto e un coperchio superiore che può essere rimosso, in modo che l’utente può regolare la posizione di tiro dei sistemi micro-dosaggio nonché impostando con precisione un nuova proteina dro plet sul vetrino coprioggetti.
Il metodo di cristallizzazione interattiva utilizzando il dispositivo di cui sopra è una tecnica affidabile per la produzione di dimensione-controllata di cristalli della proteina. Anche se molti metodi di cristallizzazione sono attualmente disponibili, informazioni interne sulla cristallizzazione meccanismo stesso non è facilmente realizzabile. In generale, l’applicazione di metodi convenzionali di cristallizzazione consente solo un controllo limitato su una soluzione nel diagramma di fase di cristallizzazione, con solo poche possibilità di cambiare il suo corso una volta che ha iniziato un esperimento. Durante l’esecuzione di una cristallizzazione sperimentare e applicando tale una tecnologia di cristallizzazione automatizzata accoppiata con in situ DLS, una grande quantità di conoscenze è maturata sulle transizioni del diagramma di fase. In generale, le regioni con conseguente precipitato amorfo e l’induzione di nucleazione omogenea sono vicino a vicenda del diagramma di fase. Pertanto, modificando il corso di una goccia di cristallizzazione basata su informazioni in tempo reale della distribuzione delle particelle, è possibile evitare la precipitazione di una proteina regolando gradualmente le condizioni di cristallizzazione verso nucleazione e Formazione di cristalli.
Al giorno d’oggi, molte condizioni di cristallizzazione includono precipitante soluzioni dove il polietilenglicole (PEG) derivati sono ampiamente presenti. Tali composti hanno solitamente una viscosità elevata che può possedere le difficoltà per pipettaggio o erogazione. Nel presente caso di studio, i sistemi di micro-dosaggio che vengono utilizzati per l’erogazione precipitante applicano capillari molto sottili che rendono possibile l’aggiunta di incrementi picolitri. Di conseguenza, ci sono alcune limitazioni nel funzionamento con sostanze altamente viscosi. All’interno di una serie di esperimenti precedenti, il sistema ha dato risultati positivi utilizzando il seguente derivati del PEG: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Anche se finora sono state testate solo le soluzioni di cui sopra, i sistemi di micro-dosaggio contengono un meccanismo di riscaldamento speciale che può essere utilizzato per fare diminuire la viscosità di una soluzione. Un altro fattore è soluzioni saline che devono essere considerati quando utilizzato come proteina precipitante. Quando si lavora con sali altamente concentrati, una piccola quantità può cristallizzare all’ugello del sistema micro-dosaggio, causando il blocco superficiale della pompa micro-dosaggio durante aggiunta precipitante; anche quando un’umidità molto alta è presente in aula sperimentale. Per ovviare a questo problema, l’esperimento deve essere messo in attesa in modo che il sale dall’ugello può essere rimosso. Questo potrebbe richiedere una gestione speciale e potrebbe produrre errori in fase di aggiunta precipitante.
Basato sulle informazioni preziose che possono essere raggiunti quando si eseguono tali esperimenti di cristallizzazione automatizzata, questa tecnica può essere estesa anche a studi che studiano gli aspetti di chimica fisica della cristallizzazione di proteine. I tassi di reazione di crescita nucleazione e cristallo sono fenomeni cinetici che possono essere derivati e calcolati sulla base delle informazioni di dipendenza di tempo rappresentate da un esperimento come la temperatura, la crescita di dimensione delle particelle e di proteina e precipitante concentrazione.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono finanziamenti dell’Unione europea Horizon 2020 programma di ricerca e innovazione nell’ambito del Marie Sklodowska-Curie Acronym “X-sonda” Grant contratto n. 637295 e supporto tramite BMBF grant 05K16GUA e il “The Hamburg Centro per ultraveloce Imaging – struttura, dinamica e controllo della materia su scala atomica”cluster di eccellenza della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |