تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للإنتاج الخاضع للرقابة للبروتين ميكروكريستالس. تقوم العملية باستخدام جهاز الآلي يسمح للتلاعب التي تسيطر عليها لبلورة العديد من المعلمات. تبلور البروتين هو نفذتها الخاضعة للرقابة والآلي بالإضافة لبلورة الحلول أثناء الرصد والتحقيق في دائرة نصف قطرها توزيع الجسيمات في الحبرية تبلور.
Abstract
الجهاز الآلي التبلور هو تقنية براءة اختراع1 لا سيما المتقدمة لرصد التجارب تبلور البروتين بهدف التحديد المناورة التنو ونمو البلورات نحو الأحجام المطلوبة من بلورات البروتين. تبلور التي تسيطر عليها يستند إلى عينة التحقيق في عين المكان ونثر الضوء الحيوي (DLS) بينما يتم رصد كل التغييرات المرئية في الحبرية على الإنترنت بمساعدة المجهر بالإضافة إلى كاميرا CCD، مما مكن كامل تحقيق الحبرية البروتين خلال جميع مراحل التبلور. يسمح استخدام القياسات في الموقع DLS طوال كامل التجربة تعريف دقيق للحل الأرضية العالية البروتين الانتقال إلى مرحلة جديدة – تشكيل نواة الكريستال. بتحديد مرحلة التنو البروتين، يمكن أن يكون الأمثل البلورة من بلورات البروتين الكبيرة لإنتاج البروتين ميكروكريستالس. بروتوكول تجريبي يبين بلورة تفاعلية نهج يستند إلى الخطوات الآلي الدقيقة مثل مرسب الإضافة، تبخر الماء لحمل سوبيرساتوريشن عالية، وتمييع عينة للتباطؤ الناجم عن نويات متجانسة أو عكس مسار المرحلة الانتقالية.
Introduction
على مدى السنوات القليلة الماضية، استحوذت نمو البروتين المشاريع المتناهية الصغر ونانوكريستالس انتباه المجتمع البروتين-علم البلورات، لا سيما مع التطور المستمر لعلم البلورات Femtosecond التسلسلي (SFX). بسبب تألق الأشعة السينية رواية مصادر الإشعاع واستنادا إلى النتائج الناجحة التي تحققت حتى الآن، إنتاج البروتين الصغرى وأصبحت نانوكريستالس ذات أهمية عالية، مما يشكل ارتفاع طلب على إعداد مثل هذا التعليق البلورية 2 , 3-سبب كريستال صغيرة الحجم-النطاق المطلوبة لجمع البيانات في ليزر الإلكترون الحر (إكسفيلس) ومحدودية بيمتيمي التجريبية، وصف العينة قبل جمع البيانات أمر ضروري. الأساليب الأكثر شيوعاً لتوصيف البروتين تعليق المشاريع المتناهية الصغر أو نانوكريستال حتى الآن الميكروسكوب الإلكتروني وحيود الأشعة السينية مسحوق.
حتى الآن، قد تم تكييف عدة نهج من أساليب بلورة مشتركة بهدف إنتاج كميات الجزء الأكبر من بلورات البروتين مع الأبعاد في نطاق صغير ميكرومتر. يتم استخدام الأسلوب دفعة لخلط سريع من البروتينات المركزة ومرسب الحلول، وبالتالي فرض الحل عينة إلى مرحلة الأرضية العالية التي قد تكون فيها نانوكريستاليزيشن يفضل4. وتشمل أساليب أخرى سحق البلورات البروتينية الكبيرة لتشكيل الطين كريستال، التي يمكن أن تكون بمثابة تعليق خوصات التي ستستخدم ل جمع البيانات5. ومع ذلك، أحياناً قد يؤدي النتائج في حيود انخفاض الجودة، كبلورات تدهور النظام الداخلي أقل. نانوكريستاليزيشن استناداً إلى نشر واجهة مجانية أيضا بديل متاح، حيث يتم إضافة حل البروتين بكميات صغيرة إلى حل مرسب مركزة للغاية3. بيد أنه يبدو الأساليب الأكثر فعالية بين جميع التقنيات، بلورة دفعة وأكثر تقنيات التلاعب مبتكرة باستخدام أساليب نشر بخار في الجلوس قطرات6.
وبصفة عامة، لبلورة البروتين يجب أن عبرت حاجز الطاقة لدعم نويات-الخطوة الأولى في تشكيل الكريستال دينامي حراري. من أجل نقل الحل البروتين من دولة مستقرة [ثرمودنميكلي] إلى سوبيرساتوريشن وأخيراً للحث مرحلة انتقال، بعض المتغيرات ذات الصلة بحل البروتين تحتاج إلى تعديل. هذه المتغيرات هي عادة ما تركز حل البروتين، والتغيرات البيئية (على سبيل المثال-، درجة الحرارة والرطوبة)، خصائص المذيبات (مثلاً، الرقم الهيدروجيني، قوة الأيونية)، خصائص تركيز والمخزن المؤقت، إلخ7 ،8 عادة تمثل لمحة عامة عن عينة المعلمات التي يمكن تغييرها عن طريق مخططات المرحلة، التي تسمح لأنماط مختلفة من العرض التقديمي، مثل القابلية للذوبان في المخططات أو الرسومات التخطيطية لمرحلة التنو حتى أكثر تفصيلاً وصف فيها مخططات ثلاثية الأبعاد أو أكثر تعقيداً يمكن أن تأتي إلى النظر في8،،من910. أنواع الرسومات التخطيطية للمرحلة الأكثر جاذبية عادة ما تكون ثنائية الأبعاد، حيث المتغير الرئيسي هو تركيز البروتين كدالة لمعلمة أخرى، في حين يتم الاحتفاظ المعلمات المتبقية مستمر6،11. حالما يتم تشكيل نواة واحدة أو عدد قليل، يمكن أن تنمو بلورات أكبر بتناول البروتين الإضافي من حل الجزء الأكبر. عندما تهدف لإنتاج نانوكريستال والصغرى، نهجاً تبلور تقليدية ليس ممكناً بعد الآن نظراً للعدد الصغير من البلورات الموجودة في الحل. عادة ما يكون معلقات خوصات أن تكون غنية في الكيانات البلورية، وبالتالي مسار تبلور يجب أن يمكن تعديلها، مثل أن يكون هناك ماكسيما التنو الأحداث الموجودة في العينة. ونتيجة لذلك، يتطلب هذا التحقيق بعض جديدة، حتى الآن غير مستكشفة التنو مسارات للبروتينات، والتي هي أيضا حتى الآن غير مفهومة تماما12،13. استناداً إلى أسس رسم تخطيطي للمرحلة المذكورة سابقا، النظرية الكلاسيكية قد مددت إلى فرضية جديدة، حيث يرد وصف التنو كآلية خطوتين: أولاً، انتقال إلى أعلى تركيز بروتين يأخذ مكان (كثافة السائل المرحلة) والثانية، وانتقال من مرحلة الغني بكثافة إلى أعلى نظام داخلي (نويات كريستال مع بنية شعرية)14،،من1516. تبلور البروتين حساس للعديد من العوامل، وذلك عندما يتم تعديل وصفات التبلور ينتج بلورات مختلفة الحجم، الوصفات لا يمكن دائماً الاعتماد على المعرفة السابقة. رؤى جديدة تحتاج إلى إنشاء لكل هدف البروتين الفردية: تعديل تكوين المخزن المؤقت والنقاء والاستقرار المعارف عينة ودقة للذوبان في البروتين، إلخ.
تشتت الضوء الحيوي هو اليوم طريقة راسخة للتحليل والتحسين من عمليات تبلور البروتين، نظراً لحجم مجموعة واسعة من الجزيئات التي يمكن أن تحقق: من البروتينات أحادي نانوكريستالس وميكروكريستالس الصغيرة. الأسلوب الذي يستغل خضوع البراونية الجسيمات في الحل، وأن متوسط سرعة هذه الحركة يتحدد حجم الجسيمات، من الطاقة الحرارية، واللزوجة المتوسطة وهندسة الجسيمات. في البداية، مضاءة المتوسطة السائل بمصدر ضوء متماسك باستخدام الليزر. على ضوء متناثرة في جزيئات تشكيل نمط تدخل. لأن الجزيئات في حركة دائمة أيضا تغيير نمط التدخل بشكل دائم. عندما تبحث في اتجاه معين، يمكن ملاحظة شدة التقلبات. يتم عرض هذه التقلبات الآن حركة الجسيمات الناتجة عن الحركة البراونية. ويحسب من تقلبات قياس كثافة دالة ترابط تلقائي (ACF). تحليلاً للجوع سوف تعطي مقياسا لتوزيع السرعة (معامل نشر مزيد من الدقة) الجسيمات وعن طريق استخدام المعادلة ستوكس-اينشتاين، يتم تحويلها إلى توزيع جسيمات نصف قطرها17. يمكن الاطلاع على معلومات إضافية تتعلق بوظائف دائرة الأراضي والمساحة، ومبدأ العمل في مختلف المنشورات والكتب18،19.
هنا يمكننا تطبيق ووصف جهاز بلورة إليه فريدة من نوعها، XtalController900، نسخة مطورة من إكستالكونترولير التكنولوجيا6، وضعت تحديداً لرصد التجارب تبلور البروتين التفاعلي. ويبين هذا الأسلوب عالية المحتملة لتحديد وتعقب الأحداث التنو في الوقت الحقيقي، مما يسمح المناورة الدقيقة من خلال الرسم التخطيطي مرحلة التبلور. ويهدف هذا الإجراء خاصة تبلور الأمثل تبلور البروتينات للحصول على جودة عالية البروتين الصغرى ونانوكريستالس التي مناسبة للتطبيقات استخدام مصادر الأشعة السينية السنكروتروني تركز على الصغير، حيود الإلكترونات، أو سفاكس.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم الجهاز التبلور لرصد والتعامل مع المعلمات حاسمة خلال تجربة تبلور استناداً إلى أسلوب نشر بخار معدلة. هذا الأسلوب يتيح الرصد والتهديف تجربة تبلور بروتين في جميع المراحل، مما يتيح للمستخدم لمعرفة دقيقة والسيطرة لحل البروتين طوال مرحلة تبلور الرسم التخطيطي، استناداً إلى في الموقع تحليل DLS تعليق عينة.
ويتألف الجهاز تبلور دائرة تجريبية (الشكل 1) متصل بكاميرا CCD يتيح الرصد في الوقت الحقيقي لبلورة الحبرية. الكاميرا تكييف مجهر مجهزة بعدسات تكبير مختلفة، توفير حل مكانية قصوى لما يقرب من 2.5 ميكرون. جوهر الدائرة التجريبية ميكروبالانسي أولتراسينسيتيفي لتتبع تطور وزن العينة بمرور الوقت. الإجراء تبلور يناظر تجربة الجلوس-قطره بخار-نشر، حيث يتم وضع انخفاض البروتين في ساترة سيليكونيزيد، التي يتم وضعها على ميكروبالانسي. استناداً إلى التغيرات الوزن من الحبرية، التي هي سبب مرسب إضافة أو إضافة الماء/مضافة أو تبخر العينة، ميكروبالانسي يعطي مدخلاً دقيقة إلى خوارزمية لحساب فوري لتركيز البروتين ومرسب على مر الزمن . وباﻹضافة إلى ذلك، المعلمات بلورة هامة مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية دقة رصد وتسيطر.
من أجل إجراء تجربة تبلور، مجهز الجهاز مع اثنين من أنظمة الجرعة الصغرى (اتصل بمضخات كهرضغطية مجاناً) التي تعمل في نطاق بيكوليتير لإضافة مرسب والمياه. من خلال العمل مع مثل هذه الكميات الصغيرة من المواد، يتم تصغير التدرجات تركيز وظاهرة الحمل الحراري داخل الحبرية البروتين. أن الدور الرئيسي للمضخات كهرضغطية هو إضافة مرسب أو المياه، فعلى سبيل المثال تستخدم كتعويض عن التبخر الطبيعي من الحبرية البروتين. وقد نظم الجرعات الصغيرة مجموعة من الميزات التي يمكن أن تملي إضافة مادة. تتضمن هذه الميزات: معدل التكرار لإضافة مادة، أضيف عدد قطرات الواحدة والثانية، والعرض والارتفاع لمسار تيار الجوهر، إلخ. وعلاوة على ذلك، موقف المضخات يمكن يدوياً تعديل، مما يتيح للمستخدم أن يكون موقفا دقيقا لإضافة المواد إلى الحبرية البروتين.
ردود الفعل فريدة من نوعها تسيطر التلاعب بإسقاط تبلور يتحقق عن طريق في الموقع DLS البيانات، التي يمكن أن تظهر التغييرات المحتملة في حالة oligomeric البروتين طوال الإجراءات التجريبية بأكملها. يسمح الأسلوب التقييم المستمر لتوزيع حجم الجسيمات مع مرور الوقت، مما يكشف عن الآليات المتعلقة بالبروتين غير معروف. يتم وضع معدات البصريات DLS استراتيجيا أسفل منطقة ساترة، والسماح لشعاع الليزر وكاشف يمر ساترة وكذلك عن طريق الحبرية البروتين بطريقة في الموقع ؛ ولذلك، يتم تسجيل التغييرات فقط داخل الحبرية عن طريق دائرة الأراضي والمساحة. للسماح لسهولة التعامل، الجهاز يحتوي على فتحتين: باب الأمامي للموضع الأمثل ساترة وعلى غطاء العلوي الذي يمكن إزالته، حيث أنه يمكن للمستخدم ضبط موقف إطلاق النار نظم الجرعات الصغيرة، فضلا عن الإعداد بدقة درو بروتين جديد بليت في ساترة.
الأسلوب تبلور التفاعلية باستخدام الجهاز المذكور أعلاه تقنية موثوقة للتحكم في حجم الإنتاج من البلورات البروتينية. على الرغم من أن العديد من بلورة الأساليب المتاحة حاليا، داخل معلومات حول البلورة الآلية نفسها لا يمكن تحقيقها بسهولة. بشكل عام، تطبيق الأساليب التقليدية تبلور يسمح سوى سيطرة محدودة للتوصل إلى حل في الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور، مع إمكانيات قليلة فقط تغيير مجراه وقد بدأت تجربة مرة واحدة. أثناء أدائهم لبلورة التجربة وتطبيق هذه تكنولوجيا تبلور الآلي يقترن في الموقع DLS، عظيم اكتساب قدر من المعارف حول التحولات في الرسم التخطيطي للمرحلة. وبصفة عامة، المناطق مما يؤدي إلى ترسبات غير متبلور واستحثاث التنو متجانسة قريبة من بعضها البعض في الرسم التخطيطي للمرحلة. ذلك، عن طريق التلاعب في مجرى معالجة تجميعية تبلور استناداً إلى المعلومات في الوقت الحقيقي حول توزيع الجسيمات، فمن الممكن تجنب ترسيب البروتين عن طريق تعديل شروط تبلور اتجاه التنو تدريجيا و تشكيل الكريستال.
في الوقت الحاضر، تشمل العديد من بلورة شروط الحلول مرسب فيها مشتقات البولي إثيلين غليكول (شماعة) موجودة على نطاق واسع. عادة ما تكون هذه المركبات من لزوجة عالية التي يمكن أن تمتلك صعوبات بالنسبة بيبيتينج أو الاستغناء عن. في دراسة الحالة الراهنة، تطبيق نظم الجرعات الصغيرة التي يتم استخدامها لصرف مرسب الشعيرات الدموية رقيقة جداً التي تجعل من الممكن إضافة زيادات بيكوليتري. نتيجة لذلك، توجد بعض القيود في العمل مع المواد عالية اللزوجة. ضمن سلسلة من التجارب الماضية، النظام قد أعطى نتائج إيجابية باستخدام مشتقات شماعة التالية: PEG200 50%، PEG3000 20%، PEG6000 10%، PEG800010%. على الرغم من أن حتى الآن تم اختبار فقط الحلول المذكورة أعلاه، يتضمن نظم الجرعات الصغيرة إليه تدفئة خاصة التي يمكن استخدامها لتقليل اللزوجة من الحل. وهناك عامل آخر هو الملح الحلول التي يتعين النظر فيها عند استخدامها مرسب البروتين. عند العمل مع أملاح عالية التركيز، كمية صغيرة يمكن أن تتبلور في فوهة نظام الجرعة الصغرى، مما تسبب في عرقلة سطحية مضخة الجرعة الصغرى أثناء إضافة مرسب؛ حتى عندما تكون رطوبة النسبية عالية جداً الحاضرين في القاعة التجريبية. للتغلب على هذه المشكلة، يلزم التجربة يتم تأجيلها بحيث أنه يمكن إزالة الملح من الفوهة. وهذا قد تتطلب معالجة خاصة، وقد تنتج أخطاء في مرحلة إضافة مرسب.
استناداً إلى المعلومات القيمة التي يمكن تحقيقها عند إجراء مثل هذه التجارب تبلور الآلي، كما يمكن توسيع هذه التقنية لدراسات التحقيق في الجوانب الكيمياء الفيزيائية لبلورة البروتينات. معدلات رد فعل نمو نويات وكريستال هي الظواهر الحركية التي يمكن أن تستمد وتحسب على أساس المعلومات الاعتماد على الوقت يصور من تجربة مثل درجة الحرارة، ونمو حجم الجسيمات، والبروتين ومرسب التركيز.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نعترف بتمويل من أفق 2020 البحث الاتحاد الأوروبي في والابتكار برنامج تحت رقم اتفاق منحة ماري سكلودوفسكا كوري المختصر “X-المسبار” 637295 والدعم عن طريق 05K16GUA المنح الفدرالية، و “هامبورغ المركز لفائق السرعة تصوير – هيكل، وديناميات ومراقبة هذه المسألة على الصعيد الذري “الكتلة التميز الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG).
Materials
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
Referencias
- . . Patent “Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation”. , (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D’Amaré, A. R. . Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. . Dynamic light scattering: the method and some applications. , 978 (1993).
