JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

Published: December 09, 2017
doi:
10.3791/57061
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program,University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences,University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Генетический код расширения служит мощным инструментом для изучения широкий спектр биологических процессов, включая белка ацетилирования. Здесь мы демонстрируем, что снисходительный протокол использовать этот метод для генерации однородно ацетилированные белков в конкретных местах в клетках Escherichia coli .

Abstract

Показано, что столб-поступательные изменения, которые происходят в определенных позициях белков, играют важную роль в различных клеточных процессов. Среди них реверсивные лизин ацетилирования является одним из наиболее широко распространены во всех сферах жизни. Хотя были проведены многочисленные исследования acetylome массы на основе спектрометрии, далее характеристика этих целей предполагаемого ацетилирования был ограниченным. Одна из возможных причин является, что это трудно создать чисто ацетилированный белков в желаемой позиции, большинство классических биохимических подходов. Для преодоления этой проблемы, был применен метод расширения генетического кода использовать пары инженерии pyrrolysyl ТРНК синтетазы вариант и его родственных tRNA из Methanosarcinaceae видов, для прямого включения cotranslational из acetyllysine на конкретной площадке в протеина интереса. После первого применения в исследовании ацетилирование гистонов этот подход способствовал ацетилирования исследования на различных белков. В этой работе мы продемонстрировали снисходительный протокол производить site-specifically ацетилированный белки, используя модель бактерией Escherichia coli в качестве принимающей страны. Дегидрогеназа малат был использован как демонстрационный пример в этой работе.

Introduction

Столб-поступательные изменения (PTMs) белков происходят после процесса перевода и возникают от ковалентных добавления функциональных групп аминокислотных остатков, играя важную роль в почти всех биологических процессов, в том числе ген Транскрипция, реакции на стресс, клеточной дифференцировки и метаболизм1,2,3. На сегодняшний день, около 400 отличительные PTMs были определены4. Замысловатость генома и протеома в значительной степени усугубляется белка PTMs, как они регулируют активность белка и локализации и влияет на взаимодействие с другими молекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты, липиды и кофакторы5.

Белка ацетилирования был на переднем крае PTMs исследований в последние два десятилетия6,,78,9,10,11,12. Лизин ацетилирования был впервые обнаружен в гистонами более чем 50 лет назад13,14, были хорошо изучены и как известно, существуют в более чем 80 факторов транскрипции, регуляторы и различных белков15, 16,17. Исследования на ацетилирование белка не только предоставили нам более глубокое понимание ее механизмов регулирования, но также руководствуется лечения целого ряда заболеваний, вызванных неблагополучных ацетилирования18,19, 20 , 21 , 22 , 23. считалось, что лизин ацетилирования происходит только в клетках эукариот: у, но недавние исследования показали, что белки ацетилирования также играет ключевую роль в бактериальных физиологии, в том числе хемотаксис, кислотоустойчивость, активации и стабилизации острова патогенности и другие вирулентности связанных белков24,25,26,27,,2829.

Часто используемый метод биохимически характеризовать ацетилирования лизин является использование сайта Направленный мутагенез. Глютамин используется как имитировать acetyllysine из-за его аналогичного размера и полярности. Аргинин используется как лизин ацетилированные мнемосхемы, поскольку она сохраняет свой положительный заряд в физиологических условиях, но не может быть ацетилированные. Однако оба имитирует не реальная isosteres и не всегда дают ожидаемые результаты30. Наиболее строгий подход заключается в создании однородно ацетилированный белков в конкретных лизин остатков, который является трудным или невозможным для самых классических методов из-за низкой стехиометрии ацетилирования лизина в природе7,11. Эта задача была разгадана, стратегия расширения генетического кода, который использует инженерии pyrrolysyl тРНКГлу-синтетаза вариант от Methanosarcinaceae видов для зарядки tRNAпыль с acetyllysine, использует принимающей трансляционная техника для подавления UAG остановить кодон в мРНК и направляет включение acetyllysine в положение целевого белка31. Недавно мы оптимизировали этой системы с улучшение EF-ту привязки tRNA32 и модернизированный acetyllysyl ТРНК синтетазы33. Кроме того мы применили этой системы расширения включения в исследования ацетилирования малат дегидрогеназа34 и тирозил тРНК синтетазы35. Здесь мы демонстрируем протокол для генерации чисто ацетилированный белки от молекулярного клонирования для биохимической идентификации с помощью малат дегидрогеназа (MDH), который мы тщательно изучили как яркий пример.

Protocol

1. сайт Направленный мутагенез целевого гена Примечание: MDH выражается под T7 промоутер в векторе ПХДФ-1 с CloDF13 происхождения и копировать количество 20-40-34. Ввести янтаря стоп кодон в позиции 140 гена грунтовки (вперед грунтовка: GGTGTTTATGACтегA…

Representative Results

Доходность ацетилированный MDH белка был 15 мг на 1 Л культуры, в то время как одичал тип MDH-31 мг на 1 Л культуры. Очищенные белки были проанализированы на SDS-PAGE, как показано на рисунке 1. MDH одичал тип использовался в качестве позитивного управления3…

Discussion

Генетических включение канонические аминокислот (ncAAs) основана на подавление назначенного кодон, главным образом янтаря стоп кодон UAG36,37,38,39, ncAA заряженные tRNA содержащие соответствующие антикодон. Как известно, UAG код…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH (AI119813), запуск из университета Арканзас и награда от Институт бионауки Арканзас.

Materials

Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. . Posttranslational modification of proteins : expanding nature’s inventory. , (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science’s STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?. The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O’Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O’Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O’Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O’Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Tags

Site-specific AcetylationProtein AcetylationGenetic Code ExpansionPyrrolysyl-tRNA SynthetaseAmber Stop CodonE. Coli ExpressionSite-directed MutagenesisAcetyllysine Incorporation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image