Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

포스트 번역 상 수정 (PTMs) 단백질의 번역 과정 후 발생 하 고 공유 추가 기능 그룹에서 발생 하는 아미노산 잔류물, 유전자를 포함 하 여 거의 모든 생물 학적 과정에 중요 한 역할을 재생을 전사, 스트레스 반응, 세포 분화, 및 물질 대사^1,2,3 날짜 하려면, 약 400 독특한 PTMs 확인된⁴되었습니다. 게놈과는 프로테옴의 intricacy는 단백질 PTMs로 대부분 증폭 단백질 활동 및 지역화, 고 단백질, 핵 산, 지질, 및 공동 인자⁵등 다른 분자와 상호 작용에 영향을 미칠.

단백질 acetylation 지난 2 년간^{6,7,,89,10,11,12}PTMs 연구의 최전선에 왔다. Lysine acetylation 처음 발견 되었다 히스톤에 이상의 50 년 전^13,14은 잘 조사 되어, 80 개 이상의 녹음 방송 요인, 레 귤 레이 터, 및 다양 한 단백질^{15에 알려져 있다 16,17}. 단백질 acetylation에 대 한 연구 뿐만 아니라, 규제 메커니즘의 깊은 이해를 제공 하지만 다양 한 역 기능 acetylation^18,19, 로 인 한 질병에 대 한 치료 가이드 ^{20 , 21 , 22 , 23}. lysine acetylation 진핵생물에서 발생 하지만 최근 연구는 단백질 acetylation 또한 세균 생리학, chemotaxis, 내 산 성, 활성화 및 안정화를 포함 하 여 주요 역할 재생 믿어 pathogenicity 섬과 다른 독성 단백질^{24,25,26,27,,2829}관련.

Lysine acetylation 화학적 특성을 일반적으로 사용 되는 방법은 사이트 지시 된 mutagenesis 사용 하는. 글루타민은 비슷한 크기와 극성 때문에 acetyllysine의 모방으로 사용 됩니다. 아르기닌은 생리 적인 조건 하에서 그것의 긍정적인 요금을 유지 하지만 acetylated 수 없습니다 비 acetylated lysine 모방으로 활용 됩니다. 그러나, 두 모방 하지 진짜 isosteres 이며 항상 예상된 결과³⁰를 생성 하지 않습니다. 가장 엄격한 접근은 어렵거나 lysine acetylation 자연^7,11의 낮은 산출할 인해 가장 고전적인 방법에 대 한 특정 리 진 잔류물에 균질 acetylated 단백질을 생성 하는 것입니다. 이 문제는 설계 pyrrolysyl-tRNA 합성을 사용 하 여 유전자 코드 확장 전략에 의해 unraveled 되었습니다 tRNA 충전 Methanosarcinaceae 종에서 벗어나 acetyllysine와^Pyl 활용 호스트 변환 기계는 UAG를 억제 하는 mRNA에 codon를 중지 하 고 대상 단백질³¹의 설계 위치에 acetyllysine의 지휘. 최근에, 우리는 향상 된 EF-부 엉-바인딩 tRNA³² 와 업그레이드 된 acetyllysyl-tRNA 합성³³이 시스템을 최적화 했습니다. 또한, 우리는 malate 효소³⁴ 와 tyrosyl-tRNA 합성³⁵의 acetylation 연구에서이 향상 된 통합 시스템을 적용 했습니다. 여기, 우리가 우리가 광범위 하 게 실증 사례로 공부 malate 효소 (MDH)를 사용 하 여 생화학 식별 분자 클로닝에서 순전히 acetylated 단백질을 생성 하기 위한 프로토콜을 보여 줍니다.