Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione
Summary
In considerazione del principio di 3Rs, modelli respiratori in alternativa agli studi sugli animali si stanno evolvendo. Soprattutto per la valutazione del rischio delle sostanze respiratorie, c’è una mancanza di analisi appropriate. Qui, descriviamo l’uso delle fette di polmone umano di taglio di precisione per la valutazione delle sostanze trasportate dall’aria.
Abstract
Malattie respiratorie nella loro ampia diversità hanno bisogno di sistemi di modello appropriato per capire i meccanismi di fondo e consentire lo sviluppo di nuove terapie. Inoltre, la registrazione di nuove sostanze richiede appropriata valutazione del rischio con adeguati sistemi di prova per evitare il rischio di essere leso a causa, ad esempio, nell’ambiente di lavoro di individui. Tali valutazioni di rischio sono di solito condotte negli studi sugli animali. In considerazione il principio 3R e pubblico scetticismo contro gli esperimenti sugli animali, umani metodi alternativi, come le fette di taglio di precisione del polmone (tributo), sono stato in continua evoluzione. Il presente documento descrive la tecnica ex vivo di tributo umano per studiare il potenziale di immunomodulatori di sostanze a basso peso molecolare, come esacloroplatinato di ammonio (HClPt). Gli endpoint misurati includono attuabilità e infiammazione respiratoria locale, caratterizzata da alterata secrezione di citochine e chemochine. Citochine pro-infiammatorie, fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e interleuchina 1 alfa (IL-1 α) sono stati aumentati significativamente in tributo umano dopo l’esposizione ad una concentrazione sub-tossica di HClPt. Anche se la tecnica di tributo è stata ottimizzata notevolmente negli ultimi decenni, la sua applicabilità per il collaudo di immunomodulazione è ancora in sviluppo. Di conseguenza, i risultati presentati qui sono preliminari, anche se mostrano il potenziale del tributo umano come un valido strumento nella ricerca delle vie respiratorie.
Introduction
Malattie respiratorie come l’asma allergica, asma professionale, malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), enfisema e infezioni delle vie respiratorie superiori e inferiori sono in aumento e rappresentano un onere di salute in tutto il mondo1,2. Sistemi di test adatti sono necessari, al fine di identificare alcuni dei meccanismi fondamentali alla base di queste malattie, oltre che lo sviluppo e la sperimentazione di sostanze appropriati. Ricerca di base, nonché lo sviluppo di farmaci preclinici è focalizzato su risultati ottenuti in esperimenti in vitro o in vivo . Queste analisi, tuttavia, hanno loro limitazioni3. In primo luogo, saggi in vitro utilizzano cellule umane che sono sono isolate e rimosso da organi o tessuti adiacenti e così non sono più in grado di interagire con o essere protetti da altre celle3. In secondo luogo, modelli animali spesso non sono traducibili agli esseri umani a causa di differenze nella fisiologia e biochimica divergenze4. Al fine di ridurre al minimo queste limitazioni e nel contesto delle 3R (sostituzione, raffinatezza, riduzione) principio5, nuovi modelli alternativi sono in continua evoluzione.
Modelli alternativi tessuto umano 3D, come tributo, sono un collegamento tra basati su umani in vitro e modelli complessi animale in vivo . TRIBUTO riflettono l’eterogeneità funzionale con tutti i tipi di cellulari rilevanti presenti in vie respiratorie6. Inoltre, la tecnica di tributo ha il vantaggio di preparazione riproducibile di parecchie fette sottili di spessore preciso da un donatore singolo tessuto umano o animale. Questo permette un controllo interno, nonché a diverse concentrazioni o farmaci per essere testato.
Fin dalla prima introduzione di fette di polmone umano agar-riempito nel 1994 da Fisher et al. 7 la tecnica per affettare e la coltura del tessuto polmonare è stata migliorata sostanzialmente. Christian Martin et al. hanno migliorato questa tecnica per ulteriori applicazioni chimico e farmacologico8. Il nostro gruppo è stato introdotto a questa tecnica di Christian Martin nel 2007. Da allora, l’applicazione del tributo nella ricerca ha ampliato da test di risposte funzionali, quali vie respiratorie9,10 e vasocostrizione11, a immunologica, farmacologici12,13, e tossicologici7 test in varie specie in diversi laboratori. Per esempio, Schlepütz et al. 14 studiato le risposte delle vie respiratorie per differenze di specie e rispetto l’attivazione del neurone periferico mediante stimolazione elettrica a campo (EFS) o capsaicina in topi, ratti, cavie, pecore, uistitì e gli esseri umani. Hanno trovato le varie specie distinte ma diversi modelli di broncocostrizione nervo-mediata e ha concluso che gli animali di laboratorio comunemente usati (topi e ratti) non riflettono sempre la risposta umana. Per test di tossicità polmonare e di ridurre il numero di animali in questo contesto, Hess et al. 15 pre-convalidato ratto tributo come alternativa ” ex vivo ” per gli studi di tossicità per inalazione. Questo studio di pre-validazione multicentrico ha provocato lo sviluppo di due modelli di previsione tramite tributo con risultati promettenti.
Inoltre, nella ricerca di base, tributo è stati usati per delucidare segnalazione16,17risposte allergiche iniziali e infezione virale risposte18,19calcio. Il progresso tecnico è in corso e ulteriori progressi sono stati esplorati. Ad esempio, il campo è in aumento il beneficio del tessuto umano per lo stoccaggio e il riutilizzo del tessuto congelato. Rosner et al ha descritto una tecnica di congelamento e scongelamento murino tributo che conserva la capacità delle vie aeree di contratto sopra stimolazione: pertanto, la tecnica prolunga l’intervallo di tempo limitato entro il quale i tessuti rimangono valide e così più ulteriormente le analisi possono essere applicate nel corso del tempo per lo stesso donatore20. Oltre a questi progressi della ricerca, Lauenstein et al. 21 recentemente investigato la valutazione del rischio di vari prodotti chimici che potrebbero fungere da potenziali sensibilizzatori per asma professionale in tributo umano.
Asma professionale, i cui sintomi sono l’ostruzione del flusso d’aria e hyperresponsiveness della via aerea, simili all’asma allergico, è indotto tramite l’esposizione ad alto peso molecolare (HMW)22 o basso peso molecolare (LMW) sostanze23 (per esempio. , composti del platino) nell’ambiente di lavoro. LMW agenti hanno un’alta potenziale di sensibilizzazione quando formando apteni e associare al vettore proteine21. Registrazione di nuove sostanze chimiche HMW o LMW richiede in vitro e in vivo valutazione del rischio per quanto riguarda il loro potenziale di sensibilizzazione putativo (ad es., OECD Guideline 429)24. Il test utilizzato per determinare la sensibilizzazione presunta potenziale, tuttavia, non sono stati originariamente progettati per la valutazione del rischio dei sensibilizzatori respiratori, ma per contatti sensibilizzatori, anche se ci sembrava di essere alcuni congruenza per un piccolo sottoinsieme delle sostanze25 . Il lavoro di Lauenstein et al è stato progettato come parte del Unione europea progetto Sens-it-iv, per sviluppare strategie di sperimentazione alternative per la valutazione del rischio presunto contatto o polmone sensibilizzatori21. Per questo progetto, ci siamo concentrati sulla prova l’usabilità del tributo umano come uno strumento di test alternativo. Pertanto, un insieme di endpoint immunomodulatori (ad es., redditività e citochina secrezione) è stato selezionato per determinare il potenziale irritante o infiammatorio dei prodotti chimici, quali i composti del platino LMW. Lauenstein et al ha trovato nessun schema generale che potrebbe essere applicato a tutti i sensibilizzatori respiratori; Tuttavia, il loro lavoro fornito le basi per protocolli recentemente pubblicati26.
In sintesi, il protocollo presentato qui per la preparazione e successiva esposizione di tributo umano fornisce un metodo utile per la valutazione di potenzialmente polmonare tossico e/o sostanze immunomodulatorie che potrebbero essere coinvolti nello sviluppo delle vie respiratorie malattie come asma professionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica di tributo umana è ben consolidata nel nostro laboratorio. Il presente documento fornisce una descrizione di questa tecnica e il suo uso per test di tossicità delle sostanze nel tessuto del polmone ex vivo. In generale, qualsiasi laboratorio usando che questa tecnica dovrebbe cercare di impostare un’analisi correlate definizione delle gamme quantificabili, stima della variabilità e controlli di qualità garantendo la validità dell’esperimento. Possibili procedure standard potrebbero essere, ad esempio, per ripetere ogni endpoint, ad esempio, l’analisi di citotossicità, in un minimo di tre donatori biologici (singole esecuzioni) con un minimo di due o tre ripetizioni tecnici per esempio tra cui positivo e riferimenti negativi. Laboratorio personale deve essere istruito per aumentare la coerenza di dosaggio e ridurre al minimo la variabilità di analisi.
Gli endpoint frequentemente utilizzati per valutare gli effetti immunomodulatori di sostanze sul tessuto polmonare comprendono la citotossicità misurazioni utilizzando dosaggi diversi (ad es., analisi di LDH, analisi WST-1, macchiatura analisi microscopica), rilascio di citochine assays, anche come cambiamenti nel profilo di espressione e caratterizzazione dei cambiamenti in popolazioni cellulari di immunohistopathological metodi6. Inoltre, ci sono tecniche che descrivono la visualizzazione delle cellule, quali le cellule dendritiche polmonare, in murino tributo28 che può essere trasferito anche al tributo umano e potrebbe quindi fornire la più ampia e approfondita la composizione cellulare prima e dopo il trattamento con sostanze citotossiche putativi.
Questo protocollo di base e la tecnica per la preparazione di sezioni di tessuto polmonare umano è paragonabile a tecniche che sono state descritte bene in pubblicazioni29. In breve, il materiale dell’organo è ottenuto da pazienti affetti da vivere-minacciando di malattie croniche come il cancro del polmone, che hanno sottoposto ad intervento chirurgico di resezione o trapianto. Gli studi devono essere approvati dal comitato etico locale. Consenso informato dei pazienti è richiesto. Creazione di un flusso di lavoro tra clinica e laboratorio è una questione critica e richiede comunicazione e definizione delle interfacce e delle infrastrutture tra entrambi i siti. Polmone umano materiale deve essere elaborata direttamente dopo resezione per preservare la vitalità del tessuto. Vale la pena ricordare che la tecnica qui descritta per tributo umano può essere applicata ai polmoni grandi e piccini e ai polmoni sani e malati. Negli Stati Uniti, ad esempio, è possibile ottenere i polmoni da donatori di organo sano che morti in incidenti o cui organi sono stati respinti per il trapianto.
Il primo passo fondamentale nel protocollo è l’inflazione delle vie aeree e del parenchima circostante con soluzione di agarosio. Questo passaggio è necessario per solidificare il tessuto molto morbido per la successiva procedura per affettare. La qualità del materiale di polmone umano, basato sullo sfondo la malattia, è fondamentale qui. Possono essere riempiti solo lobi con pleura intatto. I tumori di stadio finale nei pressi del Bronco a volte impediscono il processo di riempimento. Prima di gonfiare il materiale umano, la temperatura della soluzione di agarosio deve essere accuratamente controllato. Troppo sangue (o altri fluidi, essudati) dentro l’essere umano del tessuto polmonare si tradurrà in diluizione indesiderato di agarosio e influenzerà il processo di polimerizzazione. Dopo l’inflazione del tessuto polmonare e gelificanti di agarosio su ghiaccio, i polmoni sono tagliati in sezioni di spessore di 200 a 300 µm. Consistenza del tessuto è un problema molto critico. Se il tessuto è troppo morbido, taglio di sezioni uguali è difficile. Anche se la stessa microtomo parametri vengono impostati per ciascun donatore, lo spessore delle fette tra i donatori può variare, dovuta a singole condizioni e modifiche durante il gonfiaggio elaborano per ciascun polmone. Disomogenea riempimento del tessuto si tradurrà in spessori di sezione diversa. Invece di misura e lo spessore delle fette di standardizzazione, misura del contenuto proteico totale può essere utilizzato per monitorare indirettamente spessori fetta del polmone. Parecchie malattie di stadio finale ostacolano il processo di sezionamento; ad esempio, sangue vasi sono estremamente ispessiti in ipertensione polmonare e tessuto fibrotico può essere così rigido che affettare di cilindri di tessuto è appena possibile e la lama del microtomo deve essere sostituito molto spesso.
Dopo la preparazione del tributo umano e fasi di lavaggio intensivo, che sono necessarie per rimuovere i detriti cellulari e rilasciato enzimi, tessuto sezioni possono essere utilizzati per esperimenti29. TRIBUTO umano è coltivate in condizioni di coltura delle cellule normali ed esposti, per esempio, sostanze chimiche, farmaci o lipopolisaccaridi. Occasionale contaminazione di tributo a causa di infezioni (sconosciute) è un numero speciale nella cultura del materiale del polmone umano. Colture di tessuti mostrando infezioni devono essere scartati e l’apparecchiatura deve essere disinfettata accuratamente. Separazione spaziale tra luoghi di laboratorio utilizzati per la preparazione di un lato e coltura, d’altra parte, può aiutare per evitare infezioni crociate. Per quanto riguarda l’attrezzatura, il microtomo può esaurire e viti a testa esagonale allentati può portare a danni al motore e arresto del movimento della lama. Non ogni parte dell’affettatrice è fatta di acciaio inossidabile, e così esso si ossida se non asciugati immediatamente modificare pulizia. Per ovviare a problemi di attrezzature, può essere necessario disporre di almeno un dispositivo di backup.
In precedenti pubblicazioni, dell’agarosi sono stato segnalato per essere lavato fuori e rimosso durante intensi fasi di lavaggio dopo la preparazione. In realtà, questo non è possibile, l’agarosio non può essere rimosso. Per la rimozione completa di agarosio, ha bisogno di essere ri-fuso a temperature elevate, che avrebbero distrutto il tessuto. L’agarosio in alveoli e airways non interferisce con gli endpoint descritti. Altri endpoint potrebbe essere influenzato dalla presenza di agarosio (veda inoltre limitazioni). La necessità di preparare le sezioni di tessuto molto fresco deve essere sottolineato, come la vitalità del tessuto è una questione critica nella cultura. Broncocostrizione non è un parametro valido per la vitalità. Si consiglia di utilizzare almeno due o tre saggi di citotossicità indipendente per verificare la fattibilità del parenchima circostante; Questo deve essere verificata in ogni esperimento30. Controlli di qualità nelle analisi di citotossicità servono come indicatori di redditività di tessuto insufficiente. Pertanto, si raccomanda di valutare la capacità di risposta del tessuto, ad esempio, per un’efficace sostanza tossica come un detergente in tutti i saggi di citotossicità. Basato su curve dose-risposta, valori minimi e massimi di assorbimento devono essere definiti per saggi di citotossicità e incontrato per esperimenti successivi. Ulteriori modifiche al protocollo dipendono principalmente i prodotti chimici applicati e gli endpoint di interesse. L’applicabilità di sostanze chimiche altamente reattive o insolubile è limitato. La più alta concentrazione di solvente per DMSO è limitata all’1%. Concentrazioni più elevate possono essere utilizzati, ma possono provocare marcato rilascio di citochine pro-infiammatorie, quali IL-8. D’altra parte, lo stimolo utilizzato potrebbe essere relativamente debole. In questo caso, la quantità di tessuto può essere aumentata da due a quattro fette per pozzetto. Questo approccio limita la redditività a 24 h.
Una limitazione importante di tributo umano è che in Germania possono solo essere preparate da materiale di polmone umano malato. I pazienti che subiscono la chirurgia sono normalmente più di 50 anni e 80% dei pazienti affetti da cancro del polmone sono o utilizzata per essere fumatori. Farmaco di pazienti, quali i glucocorticoidi, può anche influenzare il risultato degli esperimenti utilizzando tessuto umano. Pertanto, è essenziale: i) convalidare ogni esperimento di riferimenti positivi verifica redditività, funzionalità e la sensibilità del tessuto individuale e ii) Croce-convalidare i risultati utilizzando tessuto polmonare sano, non malate, mezza età da animali da laboratorio (primati non umani come cynomolgus e, se possibile, mouse, ratto, cavia). Meglio il Punteggio di patologia del tessuto malato, meglio i risultati sperimentali. Tessuto pesante malato difficilmente può essere utilizzato e molto spesso spettacoli limitata redditività, i livelli di citochina insufficientemente bassa o estremamente alta, infezioni batteriche o fungine e meno broncocostrizione. Variazione di donatore a donatore è superiore rispetto con i risultati ottenuti da animali da laboratorio, che riflette la variabilità individuale degli esseri umani. Questo, tuttavia, non è una limitazione in generale; Come accennato in precedenza, in altri paesi (ad es., gli Stati Uniti) è possibile avere i polmoni sani da donatori di organo defunto rifiutati per trapianto. La reattività del tessuto è stato ben descritto per la prima fino a 48 h in esperimenti di esposizione acuta. Vitalità e funzionalità del tessuto è ridotta dopo molti giorni di cultura o dopo conservazione a-80 ° C. È possibile al tessuto polmonare umano di cultura per fino a circa 14 giorni. Attuabilità continua durante questo periodo; Tuttavia, si è osservato un aumento nella variabilità, nonché una perdita di funzionalità delle diverse popolazioni di cellule, quali i macrofagi, nel tessuto, con conseguente rilascio di citochine limitato in risposta ai mitogeni. Un’altra limitazione per alcuni endpoint è la presenza di agarosio nel tessuto, ostacolare, per esempio, l’isolamento di alta qualità e sufficiente quantità di RNA31 o la preparazione di sospensioni unicellulari per citometria a flusso successivo e fenotipizzazione delle cellule. La possibilità di acquisire conoscenze meccanicistiche in cella singola risposte e funzionalità è limitata.
Modelli di tessuto organotipiche, come tributo umano, sono considerati hanno un elevato impatto sulla ricerca di base e non clinici. Polmone umano materiale ha una composizione biologica che riflette l’architettura normale dell’organo. Esso contiene, ad esempio, cellule epiteliali bronchiali ed alveolari residenziale, cellule muscolari lisce, fibroblasti, cellule endoteliali, fibre nervose e macrofagi. Il tessuto è praticabile e le cellule rispondono a stimoli diversi. Del nervo fibre, anche se tagliato, può essere attivato localmente, che conduce al terminal risposte riflesse14. Di conseguenza, questo modello ex vivo offre la possibilità di studiare la risposta immune innata cellular, risposte di difesa, cytokine signaling e induzione degli indicatori della superficie delle cellule. Diversi miglioramenti nella tecnica, la coltura e la convalida di endpoint consentono l’utilizzo di tributo umano nella scienza traslazionale. Esempi di futuri approcci sono: i) validazione di nuovi obiettivi nel tessuto polmonare umano, ii) la valutazione della risposta immunitaria dopo l’esposizione, ad esempio, a prodotti chimici, farmaci, nanoparticelle, ecc., iii) il completamento del tessuto polmonare con le cellule immunitarie, tali come T-linfociti, iv) identificazione e modifica di modelli molecolari, per esempio, dopo l’esposizione a sostanze sensibilizzanti delle vie respiratorie, sostanze che inducono malattia o composti attivi inibendo le vie; Inoltre, v) vie respiratorie che ritoccano e vi) neuronale regolamento32. Campo scientifico è interessato a questi approcci attuali e futuri con tributo. Inoltre, ci sono una varietà di diversi sviluppi che contribuirà a migliorare la tecnica di tributo, quali cryo-conservazione20ed il tessuto stretching33 per imitare il movimento naturale del tessuto durante la respirazione o meccanico ventilazione.
Il principale vantaggio di tributo umano rispetto ad altri modelli 3D è la presenza di cellule immunitarie e fibre nervose. Esperimenti possono essere eseguiti anche nel topo, ratto e primati non umani, che sono le specie animali che più spesso vengono ancora utilizzate in farmacologia e tossicologia. La complessità del tessuto polmonare umano supporta la traduzione dei risultati da animale a uomo e da in vitro de vivo. Nel contesto dei saggi alternativi esistenti per l’identificazione dei sensibilizzatori respiratori, tributo umano è molto complesse e non consentono approfondimenti le risposte delle singole cellule. Eppure, microscopia e flusso cytometry potrebbe dare informazioni su risposte cellulari, se il proprio cellulare marcatore è usato in combinazione, ad esempio, con l’apoptosi, necrosi o marcatori intracellulari. Ci sono saggi pubblicati che sono stati convalidati e segnalati siano stati utilizzati per l’identificazione dei sensibilizzatori respiratori. Tuttavia, i progressi nell’uso di tributo con tutti i loro vantaggi rispetto le analisi unicellulare stanno dando un contributo prezioso nel senso che la tecnica può essere utilizzata per high throughput screening, come descritto da Watson et al. 34 hanno sviluppato un test di screening ad alta resa per predire la tossicità delle vie aeree in murino tributo di crioconservazione. Con il loro formato di tributo 96 pozzetti miniaturizzato, essi rilevati simili letture nel fluido di lavaggio murino, che rende tributo un’analisi di alto-rendimento fattibile.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Lan Lauenstein per il suo pre-lavoro per quanto riguarda le strategie di sperimentazione alternative per la valutazione del rischio con tributo umano. Alcune delle ricerche è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Commissione europea nell’ambito del programma quadroth 6 SENS-IT-IV “Novel Testing Strategies for In Vitro Assessment of allergeni”.
Materials
| Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
| Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
| Coring tools | custom-made | custom-made | |
| Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
| Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
| Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
| Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
| Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
| Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
| Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
| TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
| Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
| Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
| Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
| Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
| LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
| Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
| Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
| BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
| Assays | |||
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
| Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
| ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
| Reagents | |||
| Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
| Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
| Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
| Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
| Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
| Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |
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