利用受刺激的排放损耗 (STED) 显微镜可视化肌动蛋白和微管骨架在 B 细胞免疫突触中的应用

当 b 细胞绑定到抗原呈现细胞 (apc) 表面上的偏振光阵列 (例如) 时, 由此产生的 b 细胞受体 (BCR) 信号驱动了典型的免疫突触结构的形成, 这首先描述在T 单元格^1,2,3,4,5,6,^7,8,9,10, ^11,12,13。最初, microclusters 抗原束缚 BCRs 形成在 B 细胞的外围: APC 接触点。这些 microclusters 然后移动到抗原接触点的中心, 在那里他们合并成一个中央超分子活化星团 (cSMAC), 形成了免疫突触的核心。免疫突触形成优化 BCR 信号和促进 BCR 介导的抗原提取从 APC 膜¹⁴。这种抗原的获取, 其次是 BCR 介导的抗原内化和随后的抗原处理, 允许 B 细胞呈现肽: MHC II 配合物 t 细胞和诱导 t 细胞帮助¹⁴。由于免疫突触形成促进 B 细胞活化, 阐明建立这种功能模式的受体组织的机制可以为如何启动和调节体液免疫反应提供新的见解。

重组肌动蛋白和微管骨架是必不可少的免疫突触形成。由空间极化的抗原引起的局部 BCR 信号诱导迅速和戏剧性地重塑肌动蛋白骨架^1,15。b 细胞周围的树突状肌动蛋白结构的形成, 推动了细胞膜的作用力, 促进了 b 细胞的扩散。这使得 B 细胞可以扫描更大面积的抗原轴承表面, 并增加 BCRs 的数量, 绑定抗原和激活 BCR 信号通路。同时, MTOC 和微管网络被重新定向到抗原接触部位。当 MTOC 接近抗原接触点时, 从 MTOC 中产生的微管沿等离子体膜的内表面延伸, 在 B 细胞和抗原轴承表面之间的界面上^16,17。这些 juxtamembrane 微管可以充当蛋白介导的 BCR microclusters¹⁸的向心运动的轨道, 导致 cSMAC 的形成。

MTOC 对免疫突触的重新定位和极化需要完整的肌动蛋白和微管骨架, 并且通常取决于皮质肌动蛋白网络和微管的相互作用^{16,17, 19,20}。皮质肌动蛋白结合蛋白, 如 IQGAP1, 可以通过与修饰微管加末端²¹的蛋白质复合物相互作用来捕获微管。这些附加端结合蛋白的动态复合体包括 EB1 和 CLIP-170, 统称为微管加端跟踪蛋白 (+ 提示)^21,22。+ 微管末端的提示可以绑定到与血浆膜或皮质肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白质。这允许产生力机制 (例如, cortically 锚蛋白沿微管的负端定向运动) 在微管上施加拉力, 从而重新定位 MTOC。CLIP-170 可以绑定到肌动蛋白相关的支架蛋白 IQGAP1²³, 我们已经表明, 这两个蛋白质是需要 BCR 诱导 MTOC 极化向免疫突触¹⁷。这种 IQGAP1-CLIP-170 的相互作用可能在协调肌动蛋白细胞骨架的重塑和微管网络在 B 细胞免疫突触的重新定位方面发挥关键作用。

常规荧光显微镜揭示了肌动蛋白和微管骨架在 B 细胞免疫突触形成中的戏剧性重组²。然而, 由于光的衍射极限, 这种方法无法详细解决小的蜂窝结构, 根据阿贝定律, 它依赖于用来照亮样品的光波长和目标²⁴的光圈。这个衍射极限限制常规光学显微镜的分辨率到200-300 毫微米在横向方向和500-700 毫微米在轴向方向²⁵。因此, 更小的亚细胞结构, 以及肌动蛋白和微管骨架的细微细节, 只能通过电子显微镜观察。细胞骨架的电子显微成像是耗时的, 需要苛刻的标本固定和准备协议, 可以改变生物结构, 并限于抗体介导的检测。immunostain 和同时图像多蛋白或细胞结构的能力是荧光显微镜的一个显著优势。此外, 在细胞中表达荧光融合蛋白能够实时成像, 并且在染色的有效抗体无法获得的情况下是有用的。

最近在超分辨率显微镜技术方面的进展克服了光的衍射极限, 允许纳米蜂窝结构的可视化²⁴。一种超分辨率显微技术被称为受刺激的排放损耗 (STED) 显微镜。STED 使用两个激光器, 其中一个激光激发荧光和一个甜甜圈形状模式的第二个激光器选择性地抑制荧光周围的荧光发射。这减少了单个荧光粒子的点传播函数 (表观面积), 并提供了一个亚衍射极限荧光图像^25,26。地面状态损耗显微镜还采用荧光技术获取超分辨率图像。然而, 图像的采集和重建时间长, 只有有限数量的显影, 可以使用, 同时高分辨率成像多骨架组件是技术上的挑战, 因为保持肌动蛋白和微管结构需要不同的固定程序。因此, STED 在电子显微术和其他超分辨显微学方法方面具有多种优势, 因为它提供了快速的图像采集, 具有极少的后处理要求, 并采用相同的显影和染色技术。用于固定样本的常规荧光显微术²⁶。

超分辨率显微术现已被用于可视化肌动蛋白结构的免疫突触在自然杀手 (NK) 细胞和 T 细胞^{26,27,28,29,30,31}. 然而, 微管细胞骨架的超分辨成像, 以及免疫突触形成过程中肌动蛋白和微管骨架的协调重组, 最近才被报道为¹⁷。我们使用 STED 显微镜的图像 B 细胞, 已获准在盖玻片涂上抗免疫球蛋白 (抗组织) 抗体, 刺激 BCR 信号和启动细胞骨架重组。在固定化的抗球蛋白抗体的镀膜下, B 细胞经历剧烈的肌动蛋白依赖性传播, 这概括免疫突触形成过程中的初始事件。重要的是, STED 显微镜揭示了在免疫突触周围形成的 F 肌动蛋白的树突环的细微细节, 并表明 MTOC, 以及附着于它的微管, 已经靠近抗原接触点¹⁷。这些微管向外延伸向 F 肌动蛋白的外围环。此外, 多色 STED 成像的各种组合的 F 肌动蛋白, 蛋白, IQGAP1 和 GFP 标记 CLIP-170 + 提示表明, 微管加端标记 CLIP-170-GFP 与周围肌动蛋白网和 IQGAP1 密切联系,皮质捕获蛋白¹⁷。

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以成像肌动蛋白和微管骨架在免疫突触使用 STED 显微术。利用 A20 小鼠 B 细胞系对这些方法进行了优化, 广泛用于研究 BCR 信号和免疫突触形成^{17,32,33,34,35,36,37,38,39}. 由于 CLIP-170 的商业抗体在以前的实验中对染色没有很好的效果, 我们详细描述了 A20 细胞中 GFP 标记 CLIP-170 的表达, 以及同时可视化的染色协议, 以三骨架成分或细胞骨架相关蛋白。在 NK 细胞免疫突触中使用 STED 显微术的图像肌动蛋白的方法已经被描述了以前的⁴⁰。在这里, 我们扩展到获取多色超分辨率图像的肌动蛋白和微管骨架在 B 细胞。

超分辨率显微镜的一个关键考虑是使用适当的固定程序来维持细胞结构和防止荧光蛋白的损伤。本文提出的固定和染色方法已被优化, 以保留 GFP 荧光和提供高分辨率成像的肌动蛋白和微管网络。在表达荧光蛋白时, 应该注意到 B 细胞通常很难染。使用此协议, 20-50% 的 A20 细胞通常表达转染的 GFP 融合蛋白, 在这个人群中蛋白质表达的水平是可变的。然而, 使用我们描述的程序, 超分辨率成像的肌动蛋白和微管是相当健壮的, 高质量的图像是容易获得的。尽管它们的尺寸相对于 A20 细胞较小, 但我们表明, 这些程序也可以用于图像的微管网络在初级 B 细胞已短暂激活的脂多糖 (LPS)。我们已经表明, 脂多糖活化的初级 B 细胞可以在相对较高的效率 (即, 这样的蛋白质消耗可以检测到免疫印迹法) 转染 siRNAs, 使其成为一个良好的替代使用 B 细胞线的一些研究¹⁷。