Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion
Summary
Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Hayvan ve bitki dokusu hücrelerinin farklı nüfus oluşur. Bu hücreler oluşturmak ve doku korumak için zaman içinde etkileşim ve bozulduğu zaman hastalığa neden olabilir. Bilim adamları özellikleri ve bu hücreler sağlam doku içinde doğal dinamikleri floresan proteinler hücre alt kümeleri arasında ifade ederek araştırmak için akıllı teknikleri geliştirdik. Ancak, zaman zaman, deneyler hücreleri tek hücre veya hücreleri nüfus şekilde, bazen doku içinde daha fazla seçili görselleştirme gerektirir. Bunu başarmak ve hücreleri nüfusu içindeki tek hücreleri görselleştirmek için bilim adamları tek hücreli photoconversion floresan proteinlerin kullanılan. Bu tekniği göstermek için biz burada nasıl UV ışığı bozulmamış bir ilgi bir Eos ifade hücreye doğrudan için Zebra balığı yaşayan gösteriyor. O zaman doku nasıl değiştirdiler belirlemek için bu photoconverted Eos+ hücreleri 24 saat sonra görüntü. Biz iki teknik tarif: tek hücre photoconversion ve hücre nüfusun photoconversions. Bu teknikler hücre-hücre etkileşimleri, hücre-kader ve farklılaşma ve hücre geçişleri, yapım o çok sayıda biyolojik sorularda uygulanabilir bir teknik görselleştirmek için kullanılabilir.
Introduction
Birden çok farklı hücre oluşturmak ve karmaşık hayvan ve bitki dokularında korumak için etkileşim. Bu hücrelerin çoğu kez ara ve yüksek çözünürlüklü mikroskobu olmadan bir tek hücre düzeyinde doku fiksasyon gerektiren komşulardan ayırt etmek zor. Ancak, nasıl bu doku formu anlamak, muhafaza ve hastalıklı olmak için nasıl tek içinde doku hücreleri araştırmak için gerekli oldu zaman içinde etkileşim vardır. İdeal olarak, bu deneyler tek hücre içinde bir doku fiksasyon zorunluluğu olmadan non-invaziv bir şekilde etiketleme gerektirir. Bilim adamları şimdi bu görev1,2,3,4gerçekleştirmek için çeşitli teknikler geliştirdik.
Keşif ve denizanası yeşil flüoresan protein (GFP) uygulanması ayrı hücre doku çevre1etiketleme için izin verilen bir heyecan verici bir yaklaşım oldu. Hücre özel Organizatör kullanarak, genetik olarak1etiketli hücre alt grubunu seçmek mümkündür. Alternatif olarak, GFP viral indüklenen ifade-ebilmek var olmak kullanmak için kullanıcı tarafından seçilen ifade GFP3,4. Her ne kadar tamamen yararlı, GFP genetik aracılı ifade kullanıcı tarafından seçilen ifade içinde bir alt doku hücrelerinin izin vermez; ve her ne kadar avantajlı, GFP, viral ifade invaziv olabilir. GFP türevleri ve farklı floresan proteinler doku içinde daha seyrek hızlı Brainbow gibi akıllı teknikleri ortaya çıkmasıyla, tek hücre ve karmaşık doku2, aralarında etkileşimleri görselleştirmek mümkün oldu 5. ancak, bu yaklaşımların bir rasgele moda hücrelerde etiket. İstenen deney görüntülenmesini tek bir hücre veya hücre deneyci tarafından tanımlanan nüfus gerektiriyorsa, bu nedenle sınırlıdır. Bu tür deneyler, bu, bir tek hücre biçimde ayırt etmek için manipüle edilebilir bir genetik olarak ifade edilen floresan protein için avantajlı olur diğer ve floresan floresan hücreleri ondan.
Bu hedefe ulaşmak için ve hücre biyolojisi karmaşık canlı bir doku içinde tek hücre görselleştirmek için tek hücre photoconversion farklı floresan proteinler6,7,8bilimsel topluluk kullanır. Genetik olarak kullanarak kontrol ifade bir yeşilden için UV maruz kalınca kırmızı floresan durumu geçişleri photoconvertible protein (Yani, eos, kaede, vb) (488 nm) ışık, biz tek bir hücre fluorescently etiketli ayırt edebilirsiniz Komşular6,7,8. Bu yaklaşım bizim confocal mikroskop lazer yığın ışıktan ilgi bir kırınım-sınırlı bölgesine doğrudan bağlı bir aparat kullanır. Bu teknik ile biz de tek hücre veya bir kullanıcı tarafından tanımlanan şekilde9,10,11daha büyük nüfus etiketleyebilirsiniz. Viral GFP tek hücre enjeksiyonlari karşılaştırıldığında minimal invasif tekniktir. Kavramının bir kanıtı olarak, biz bir gangliyon periferik sinir sistemi ve spinal kord9,10ventral tarafında bulunan hücreler gibi photoconvert daha büyük nüfus içindeki photoconvert tek hücreleri elimizden göstermek, 11,12. O zaman onların hareket ve farklılaşma geliştirme sırasında bir anlayış kazanmak için bu photoconverted hücre popülasyonlarının 24 saat sonra görselleştirebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karmaşık dokularda, farklı hücre tipleri belirli etki alanlarına düzenleyin. Son zamanlarda teknikleri bu büyük doku yapıları1,2,3içinde etiket tek tek hücreler için kullanılması. Burada benzer şekilde tek hücre etkileşimleri ve karmaşık dokularda hücre nüfus etkileşimleri görselleştirmek için kullanılması gereken iki teknikleri göstermektedir. Photoconversion tekniği belirgin bir hücre etiketlemek…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bernard Kulemaka ve onların yararlı yorumlar ve reaktif rehberlik, Sam Connell ve Brent Redford, Zebra balığı bakımı için görüntüleme sorular ve Deborah Bang, Karen Heed ve Kay Stewart fielding için 3i Smith laboratuara üyeleri teşekkür ederiz. Bu eser Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre ve kök hücre Merkezi ve Notre Üniversitesi, Rejeneratif Tıp Üniversitesi, Notre Dame, Elizabeth ve Michael Gallagher aile, Alfred P. Sloan Vakfı, Merkezi tarafından desteklenmiştir Dame. Tüm hayvan çalışmaları Notre Dame Üniversitesi ile uyumlu IACUC Dr Cody Smith için yapıldı.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
Referencias
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
